纳豆芽孢杆菌优良菌株的筛选及人工消化液耐受性研究

焦苗苗，李宏梁＊，曾桥，樊璐，赵欣

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，西安 710021；2.陕西宏梁食品科技有限公司，西安 710065）

纳豆芽孢杆菌优良菌株的筛选及人工消化液耐受性研究

焦苗苗1，李宏梁1＊，曾桥1，樊璐2，赵欣2

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，西安 710021；2.陕西宏梁食品科技有限公司，西安 710065）

从市售的燕京、顺食真、御城3种品牌的纳豆中利用脱脂牛奶平板分离初筛得到35株疑似纳豆芽孢杆菌，经琼脂糖-纤维蛋白平板复筛得到1株纤溶酶活性相对较高的菌株CN11；进行形态特征、生理生化特性及16SrDNA分子生物学鉴定，确定CN11为纳豆芽孢杆菌。对该菌进行人工消化液耐受性实验，结果表明：CN11在pH 1.5，2.5，3.5的人工胃液中作用，活菌数随pH的降低和作用时间的延长而逐渐下降，但最终仍在107cfu/mL以上；在人工肠液中作用，活菌数随作用时间的延长缓慢上升，最终为5.7×108cfu/mL；在含0.3%牛胆盐的培养基中生长，活菌数随培养时间的延长而下降，但最终仍在108cfu/mL以上；可见CN11对人工消化液有很强的耐受性。因此，CN11是一株具有相对较高纤溶酶活性，并对人体消化道逆环境有较强耐受力的纳豆芽孢杆菌。

纳豆芽孢杆菌；筛选鉴定；人工消化液；耐受性

纳豆芽孢杆菌是日本的一种传统发酵食品——纳豆的发酵菌种，属细菌科芽孢杆菌属，是美国FDA公布的40种益生菌之一［1］。纳豆芽孢杆菌不仅能在生长过程中产生多种生理活性物质，如纳豆激酶、超氧化物歧化酶（SOD）、血管紧张肽转化酶（ACE）、Pyrazine、VK2等［2，3］，使纳豆具有溶解血栓、降低血液粘稠度、抗氧化、抗肿瘤、降血压、预防骨质疏松等保健功能［4－6］；而且能在被食用后进入肠道生活达几周，促进肠道益生菌的繁殖，抑制肠道致病菌的生长，维持并调节肠道微生态平衡，增强机体免疫力［7］。所以，纳豆芽孢杆菌是一种优良的益生菌，但目前国内外研究纳豆芽孢杆菌主要集中在其产物纳豆激酶，而对纳豆芽孢杆菌作为益生菌的生物特性研究较少。因此，本实验以市售的3种品牌的纳豆为原料，利用脱脂牛奶平板和琼脂糖-纤维蛋白平板分离筛选纤溶酶活性相对较高的纳豆芽孢杆菌，进行形态特征、生理生化特性和分子生物学鉴定，并研究其对人工消化液的耐受性，为该菌株作为益生菌的功能应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试样品

燕京纳豆 北京燕京中发生物技术有限公司；顺食真纳豆 北海道小樽市钱函株式会社；御城纳豆大连美屋食品有限公司。

1.1.2 主要试剂

伊利高蛋白脱脂高钙奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司；琼脂糖 Biowest公司；纤维蛋白源（牛血）、凝血酶（牛血） 中国食品药品检定所；细菌DNA提取试剂盒TaqDNA聚合酶、DNA胶回收试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；DL 2000Marker 上海晨易生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶 Sigma公司；牛胆盐 北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为生物试剂或分析纯。

1.1.3 培养基

脱脂牛奶培养基：脱脂奶粉2%，琼脂粉2%，pH 7.0～7.2。斜面培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂1.5%，pH 7.0～7.2。液体种子培养基：胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，pH 7.0～7.2。液体发酵培养基：蛋白胨0.2%，葡萄糖2%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，K2HPO40.4%，pH 7.0～7.2。

1.1.4 仪器与设备

BSC-1300II超净工作台，SPX-250B-Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-40II型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；THZ-C-1全温振荡器 上海中庸检验设备有限公司；TH-2050R台式高速冷冻离心机 上海博翎仪器设备有限公司；BK 5000生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司；MyCycler PCR仪 美国Bio-Rad公司；WD-9413A型凝胶成像分析仪 北京市六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 纳豆芽孢杆菌的分离与初筛

称取市售3种品牌的纳豆各10g分别置于90mL灭菌生理盐水中，120r/min振荡30min，85℃水浴20min，迅速于冷水浴中冷却至室温，制得芽孢悬液；将上述芽孢悬液用灭菌生理盐水梯度稀释，分别取10－5～10－9各稀释度的样品匀液100μL涂布于脱脂牛奶培养基，于37℃培养18～24h后，挑取符合纳豆芽孢杆菌菌落形态且水解酪蛋白透明圈与菌落直径比值较大的单菌落，在脱脂牛奶培养基上连续划线分离至纯，斜面保藏备用。

1.2.2 复筛

琼脂糖-纤维蛋白平板按照文献［8］方法制备。分别挑取初筛菌株各1环接种于液体种子培养基中（装液量50mL/250mL），37℃，200r/min，恒温培养20h，最终OD600＝7～8。按照2%的接种量将上述种子液接入到液体发酵培养基中（装液量50mL/250mL），37℃，200r/min培养48h后，取发酵液于8000r/min冷冻离心15min，分别取上清液各10μL于琼脂糖-纤维蛋白平板中点样，在37℃恒温反应18h后测量溶纤圈直径，挑选溶纤圈直径较大（纤溶酶活性相对较高）的菌株斜面保藏。

1.2.3 形态特征及生理生化特性鉴定

依据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）［9］和《常用细菌系统鉴定手册》［10］对复筛得到的酶活力较高的菌株进行菌体、菌落形态和生理生化特性鉴定。

1.2.4 分子生物学（16SrDNA）鉴定

利用细菌DNA提取试剂盒提取复筛所得菌株的基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）为：2×Ex Taq Premix buffer 12.5μL，通用引物（27F/1492R）各0.5μL，模板0.5μL，ddH2O 12.5μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶中，150V恒定电压下电泳约20min，并将产物纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，所得序列与Genbank数据库中已有的细菌16SrDNA序列做Blast相似性比对分析，运用CLUSTAL X和MEGA 5.1软件选取Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.3 人工胃液耐受性实验

无菌人工胃液按照文献［11，12］方法配制。以10%的接种量将活化后的纳豆芽孢杆菌的种子液分别接入到pH值为1.5，2.5，3.5的无菌人工胃液中，37℃，180r/min摇床培养，分别于0，0.5，1，2，3h各取样1mL进行梯度稀释，平板计数法测定活菌数。

1.4 人工肠液耐受性实验

无菌人工肠液按照文献［11］方法配制。以10%的接种量将活化后的纳豆芽孢杆菌的种子液接入到无菌人工肠液中，37℃，180r/min摇床培养，分别于0，2，4，6，8h各取样1mL进行梯度稀释，平板计数法测定活菌数。

1.5 牛胆盐耐受性实验

以10%的接种量将活化后的纳豆芽孢杆菌的种子液接入含有0.3%（W/V）牛胆盐的无菌胆盐培养基中，37℃，180r/min摇床培养，分别于0，2，4，6，8h各取样1mL进行梯度稀释，平板计数法测定活菌数。

2 结果与讨论

2.1 纳豆芽孢杆菌的筛选与鉴定

2.1.1 纳豆芽孢杆菌的分离与筛选结果

纳豆芽孢杆菌生长过程中可以产生耐热的芽孢，并分泌一种既具有水解酪蛋白活性又具有很强纤溶活性的碱性丝氨酸蛋白酶——纳豆激酶［13］。依据这种特性，以水解酪蛋白透明圈和菌落直径的比值为指标，从燕京、顺食真、御城3种品牌的纳豆中共分离初筛出35株菌体和菌落形态与纳豆芽孢杆菌相似的菌株，编号为JN1～JN7，SN1～SN15，CN1～CN13。再经琼脂糖-纤维蛋白平板对35株菌株多次复筛，比较溶纤圈大小，最终确定CN11为纤溶酶活性相对较高的菌株。

2.1.2 CN11的菌体与菌落形态

将CN11在脱脂牛奶培养基上培养24h后，革兰氏染色并镜检，观察菌体和菌落形态，见图1和图2。

图1 CN11的菌体和芽孢形态Fig.1Bacteria and spores form of CN11

图2 CN11在脱脂牛奶培养基上的菌落形态Fig.2Colony morphology of CN11on skim milk growth medium

由图1可知，CN11的菌体为杆状，长度约为2～3μm，革兰氏染色呈阳性，产芽孢且为椭圆或柱状，中生或者近中生。由图2可知，CN11在脱脂牛奶培养基上生长时形成透明圈，且菌落形状为圆形，呈灰白色或乳白色，直径约为2.0～6.2mm，边缘不整齐，表面干燥粗糙、有褶皱、中间向上突起。

2.1.3 CN11的生理生化特性鉴定结果

CN11的生理生化特性鉴定结果见表1。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）可知其符合枯草芽孢杆菌的生理生化特性，初步鉴定CN11为枯草芽孢杆菌属。

表1 CN11的生理生化特性Table 1Physiological and biochemical characteristics of CN11

2.1.4 CN11的分子生物学（16SrDNA）鉴定结果

由PCR扩增产物电泳检测结果（见图3）和测序结果可知，CN11的序列长度为1463bp。将该序列与Genbank数据库中已有的细菌16SrDNA序列进行相似性比对分析并运用CLUSTAL X和MEGA 5.1软件选取Neighbor-Joining法构建系统发育树（见图4），结果表明：CN11序列与Bacillussubtilis（HQ605916.1）的16SrDNA序列同源性为100%，与Bacillussubtilissubsp.natto（EF660338.1）的16SrDNA序列同源性为99%，并且在进化树中处于同一分支。再结合CN11的形态特征、生理生化特性鉴定结果及可产生纳豆激酶的特点，可确定该菌株是纳豆芽孢杆菌。

图3 CN11的16SrDNA PCR扩增产物电泳图Fig.3Electrophoresis of PCR product of 16SrDNA from CN11

图4 CN11的系统发育进化树Fig.4Phylogenetic tree of CN11

2.2 CN11对人工胃液的耐受性

纳豆芽孢杆菌作为益生菌，必须经过胃部的逆环境并保持较高活菌数进入肠道才能发挥其益生作用，而胃液的pH值、胃蛋白酶以及菌株在胃液中停留的时间都会对其活菌数产生较大的影响［14］。一般食物（流体）经胃消化的时间是1～2h，人体胃液的pH值随着饮食的不同在1.5～5.0之间波动，一般保持在3.0左右［15］。因此，CN11必须在经过胃液的低pH和胃蛋白酶作用后仍保持较高的活菌数。

图5 CN11与不同pH值的人工胃液作用不同时间的活菌数Fig.5Changes of viable CN11count during incubation in artificial gastric fluid at different pH values

由图5可知，在pH 1.5，2.5，3.5的人工胃液中随着作用时间的延长，CN11的活菌数均存在不同程度的下降。CN11在pH 1.5的人工胃液中作用至1～2h之间时，活菌数从1.2×108cfu/mL减少至9.6×107cfu/mL，下降了1个数量级，但3h后活菌数仍在107cfu/mL以上；在pH 2.5和pH 3.5的人工胃液中作用，活菌数虽缓慢下降但始终处于108cfu/mL以上。这表明CN11对较低的pH值和胃蛋白酶具有较强的耐受力，可以顺利进入肠道发挥益生作用。

2.3 CN11对人工肠液的耐受性

益生菌必须在肠道中保持106cfu/mL以上的活菌数才能发挥其益生作用，而肠道中肠液的作用是影响益生菌活菌数的主要因素之一［16］。因此，CN11作为益生菌对肠液的作用必须有一定的抗性。

图6 CN11与人工肠液作用不同时间的活菌数Fig.6Changes of viable CN11counts during incubation in artificial intestinal fluid

由图6可知，CN11的活菌数在人工肠液中随着作用时间的延长缓慢上升，消化8h后为5.7× 108cfu/mL，说明CN11可以在人工肠液中存活并生长，这与张媛媛［17］研究复合芽孢杆菌（BS，BC）及闵钟熳等［18］研究芽孢杆菌在人工肠液中的耐受性时得出的结论是一致的，可见CN11对人工肠液的作用有很强的抗性。

2.4 CN11对牛胆盐的耐受性

胆盐对CN11活菌数的影响主要与胆盐的浓度、菌株自身的特性及菌株与胆盐的接触时间等因素有关［19］。胆盐可通过改变菌体外膜通透性影响菌株的生长，其浓度越高作用时间越长，对菌株生长影响越大。因此，CN11必须耐受胆盐的抑制作用并保持较高的活菌数才能在人体肠道中定植并发挥作用。正常人体肠道中的胆盐浓度在0.03%～0.3%（W/V）之间波动，食物通过肠道一般需要6～8h［20］，因此本实验采用肠道最大胆盐浓度0.3%（W/V）作用0～8h研究CN11对胆盐的耐受性，结果见图7。

图7 CN11对0.3%（W/V）牛胆盐的耐受性Fig.7Tolerance of CN11to 0.3%（W/V）bile salt

由图7可知，CN11的活菌数随着在胆盐培养基中作用时间的延长而下降，但在8h后仍处于108cfu/mL以上，可见CN11对胆盐具有较强的耐受性。

3 结论

本研究利用纳豆芽孢杆菌能产生水解酪蛋白和纤溶活性酶的特点，从市售3种品牌的纳豆中经分离、筛选得到1株纤溶酶活性相对较高的菌株CN11。该菌的形态特征和生理生化特性基本与枯草芽孢杆菌相同，分子生物学鉴定结果为纳豆芽孢杆菌。CN11在不同pH值的人工胃液中作用，活菌数随pH的降低和作用时间的延长而逐渐下降，在pH 1.5的人工胃液中作用1～2h时活菌数下降1个数量级，但3h后仍在107cfu/mL以上，在pH 2.5，3.5的人工胃液中作用3h后活菌数均保持在108cfu/mL以上；在人工肠液中作用，活菌数随作用时间的延长缓慢上升，8h后活菌数为5.7×108cfu/mL；在牛胆盐含量为0.3%的胆盐培养基中作用，活菌数随作用时间延长而下降，但8h后活菌数仍处于108cfu/mL以上；可见CN11对人工消化液有很强的耐受性。因此，本实验中的CN11是一株纤溶酶活性相对较高且对人工消化液具有很强耐受性的纳豆芽孢杆菌，在功能性纳豆产品中具有一定应用潜力。

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Study on Screening and Tolerance to Artificial Digestive Juice of EximiousBacillusnatto

JIAO Miao-miao1，LI Hong-liang1＊，ZENG Qiao1，FAN Lu2，ZHAO Xin2
（1.School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi＇an 710021，China；2.Shaanxi Hongliang Food Science and Technology Co.，Ltd.，Xi＇an 710065，China）

35strains of suspectedBacillusnattoare isolated from three different brands of natto，such as Yanjing，Shunshizhen and Yucheng by using skim milk plate.CN11with high activity of fibrinolytic enzyme is obtained after second screening by agarose fibrin plate.It is proved to beBacillusnattothrough morphological，physiological and biochemical characteristics＇determination and molecular identification for 16SrDNA.The study on its tolerance to artificial digestive juice is conducted.The results show that the viable count of CN11falls gradually with the decrease of pH and the increase of incubation time when the pH of artificial gastric fluid equals to 1.5，2.5and 3.5，eventually remains more than 107cfu/mL.The viable count of CN11rises slightly with the increase of incubation time in artificial intestinal fluid，and eventually achieves5.7×108cfu/mL.The viable count of CN11falls gradually with the increase of culture time in culture medium containing 0.3%bovine bile salts，eventually remains more than 108cfu/mL，which indicates that CN11has strong tolerance to artificial digestive juice.Therefore，CN11is aBacillusnattowith relatively high fibrinolytic activity and strong tolerance to reverse environment of alimentary tract.

Bacillusnatto；screening and identification；artificial digestive juice；tolerance

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.001

1000-9973（2017）03-0001-05

2016－09－15 ＊通讯作者

焦苗苗（1991－），女，陕西临潼人，硕士，研究方向：食品发酵；李宏梁（1967－），男，陕西高陵人，副教授，研究方向：食品微生物。