茶树分子遗传图谱的研究进展

石玉兰，郑楚楚，陈 丝，欧淑琼，彭 靖，王坤波

（湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128）

茶树分子遗传图谱的研究进展

石玉兰，郑楚楚，陈 丝，欧淑琼，彭 靖，王坤波*

（湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128）

简要概述了茶树分子遗传图谱构建方法和国内外茶树分子遗传图谱研究进展，并由此提出构建高密度茶树分子遗传图谱的措施，为茶树分子遗传图谱的构建提供参考。

茶树；遗传图谱；分子标记

茶树（Camellia sinensis（L.）O. kuntze）属于山茶科（Theaceae）、山茶属（Camellia）、茶组（Sect.Thea（L.）Dyer），起源于我国的西南地区[1]。二倍体（2n=30）的茶树群体在我国比较常见，但其中仍有茶树多倍体。茶树染色体着丝点大部分在中部和近中部，有少数在近端部[2]。山茶花和茶的基因组近似，大概为4000 Mb，约为拟南芥的30倍、毛果杨的10倍。由于世代周期长、基因组大、遗传负荷大和基因型高度异质杂合等特性，茶树遗传基础的研究十分薄弱。我国茶树种植历史悠久，品种资源丰富，大部分目前的栽培品种选育都来自于群体品种，常规育种方法和环境对于性状的影响和干扰是非常复杂和难以避免的。要选育出一个茶树新品种最少需要花费10～20年甚至更长时间。因此发展传统茶树育种研究迫切需要一些新的技术和理论以实现快速定向培育。

遗传图谱又称连锁图谱，是指通过遗传重组所得到的基因位点在染色体上相对距离的线性图。遗传图谱可以进行QTLs定位，得到连锁目的性状基因组片段，然后进行基因图位克隆，以为分子标记辅助选择育种奠定良好基础[3-5]。比较遗传图谱后，就能知道基因组进化的信息，接着探索出物种遗传演化的进程[6]。因此，利用DNA 分子标记构建高密度茶树遗传图谱对育种或者遗传理论研究都意义重大。

1 遗传图谱概述

基因遗传图谱的构建是建立在染色体交换和重组基础上的。细胞的减数分裂，在非同源染色体上的基因独立存在，自由组合，连锁基因在同源染色体的非姐妹染色单体上发生交换和重组，重组型配子形成，它占总配子数的比例称为重组率。重组率的高低取决于染色体交换的频率，而交换频率随基因间距离的增加而增加。因此，它们在染色体上的遗传图距可以由基因间的重组率来决定，用重组子来推算重组率即遗传作图，并且转化为遗传图谱的距离，然后在连锁群上把遗传标记依次排序的过程。经典遗传图谱主要是使用细胞学标记、形态标记以及生化标记，构建的图谱可以间接的反映染色体上功能基因的排序，但是受到标记数目的限制，进展比较缓慢；分子遗传图谱指的是采用DNA分子标记来建立的遗传图谱，因为这种标记不受外部环境条件以及所取材料影响，而且数量相当的丰富，让构建高密度遗传图谱成为一种可能[7-10]。分子遗传图谱的构建包括以下几个步骤[11]：（1）构建合适的遗传群体，包括亲本的选择、分离群体类型的选择及群体大小的确定等，根据遗传材料间的杂交亲和性和亲缘关系，确定最佳亲本组合；（2）选配作图亲本的分离群体类型以及群体大小等，建立分离群体；（3）利用合适的分子标记进行分析；（4）测定标记基因型；（5）进行连锁分析，利用计算机软件进行图谱构建。

2 茶树遗传图谱构建现状

茶树为多年生木本植物，生长周期长且异交，但茶树遗传组成高度杂合，可采用F1代作图群体的“双假测交”方法构建图谱。“双假测交”作图的原理为：两个高度杂合的亲本当中的许多遗传位点，在杂交一代即发生分离现象，当其中一亲本为杂合位点，另一亲本为纯合位点时，F1代就出现1∶1分离，即为测交；当亲本的双亲都是杂合位点时，杂交一代中出现3∶1分离时为显性标记；出现1∶1∶1∶1或 1∶2∶1分离时为共显性标记；因此可用来构建双亲分子连锁图和判断双亲间的同源连锁群[12]。“双假测交”法构建遗传图谱目前适用于多数木本植物[13-15]。

一直以来对茶树遗传图谱的研究相对其他作物比较滞后。1996年，第一张茶树遗传图谱被田中淳一采用“双假测交”的方法报道，以RAPD标记对薮北×静-印杂131的F1分离群体作图，构建了部分遗传图谱（包含6个连锁群），并发现与炭疽病抗性、抗冻能力、多酚类含量、萌芽早晚相连锁的RAPD标记；但其由于连锁群数与茶树染色体数差异大以及标记数量受限，因此QTLs定位及连锁分析的精确度并不高[16]。2002年，Hackett等以SFS150为母本的半同胞F1群体，采用RAPD和AFLP标记构建的茶树遗传图谱平均图距为11.7cM，包含15个连锁群，126个标记[17]。2005年，国内第一张茶树遗传图谱由黄建安等用69份祁门4号和潮安大叶茶的杂交F1作为实验材料，使用AFLP标记技术构建，其中母本图谱的208个AFLP标记分布于17个连锁群上，总图距为2457.7 cM，标记间最大距离为42.3 cM，最小距离为1.2 cM，平均间距为11.9 cM；17个连锁群中，最大的连锁群分布有43个标记，图距达514.2 cM，标记间最大距离为27.5 cM，最小距离为1.9 cM，平均间距为12.2 cM[18]。2006年黄福平等使用16个ISSR和46个RAPD标记成功构建了福鼎大白回交l代遗传连锁图，总图距是1180.9 cM，标记间的平均距离是20.l cM；当中连锁群LG4覆盖的遗传距离最大是309.3 cM，其中LG6包含的标记数最多，总共18个标记，平均距离为15.7 cM[19]。2010年Kamunya等采用42个茶树后代，成功构建了包含30个连锁群的连锁图谱，总图距是1411.ScM，标记间的平均距离是14.1 cM；同时进行了茶树产量的QTL定位，检测出有23个QTLs位点和产量显著相关，其中15个QTLs遗传来自母本，8个遗传来自父本[20]。另外，日本等国科学家在双假测交的基础上，采用ISSR、 AFLP、RAPD和SSR标记同样构建了茶树的一部分遗传连锁图[21]。2012年Taniguchi等利用SSR、RAPD、STS和CAPS标记，同时整合了之前的两张图谱，是目前为止标记密度最大、基因组覆盖最全面的茶树遗传图谱，当中以279个SSR标记为主的核心图谱长度是1218 cM，但是只有54个F1单株的作图群体[22]。2013年马建强构建的双亲遗传图谱共15个连锁群，与茶树染色体数一致，包含1101标记（SSR，373；SNP，728），图谱覆盖基因组长度1632.8 cM，相邻标记间最大距离19.6 cM，最小间距0.1 cM，平均图距为1.5 cM，连锁群长度范围80.2～184.8 cM[23]。

目前为止构建的茶树遗传图谱有的精确度和密度有限，虽然给茶树遗传与育种研究带来了动力，但是要展开有价值的应用还比较困难，造成的原因主要包括：（1）分离群体较小。衡量遗传图谱的质量高低是以这些遗传标记在图谱中位置的精确性为准而不是取决于标记数目的多少[24]。染色体的同源重组决定了标记在图谱中的位置顺序，所以在构建图谱时就需要一定数量的作图个体以确保检测到减数分裂时的重组事件，因此作图群体的大小决定了遗传图谱的饱和度，同时还决定了从随机分离结果可以辨别的最大图距和两个标记间检测到重组的最小图距。由于工作量和成本的限制，需150个左右单株才能构建分子标记框架图，在进行精细研究某个连锁区域的时候，要将作图群体扩大到300个以上[21,25]。（2） 分子标记的数量不足。用于QTLs初步定位的遗传图谱就要求标记间平均距离在10 cM以下，如果要进行图位克隆要求平均距离在1 cM以下。（3） 分子标记的种类。除了少数报道的茶树遗传图谱是利用共显性SSR标记外，其他的图谱都是用开发成本相对较低、能够进行快速作图的RAPD和AFLP标记为主，但这类标记是对基因组的随机扩增，重现性和保守性较差，在不同的研究群体中具有一定的差异，因此构建的图谱及利用图谱解析的QTLs具有组合特异性，无法进行比较分析；同时在图谱上发现的标记间和标记与基因间的关联是一种随机关联[26-27]；且因其扩增片段多位于非编码区，不能直接用于分离目标基因[28]；使其实际应用推广受限。

3 构建高密度茶树遗传图谱的方法

现阶段已建成的遗传图谱与实际中应用需求相差较大，因受基因组覆盖率和图距等限制，因此，对以下几点的深入研究十分迫切。

3.1 选择优良亲本

使用分离群体作为遗传材料构建遗传图谱，因为群体亲本的选择将直接影响到遗传图谱构建的难易程度和图谱的应用范围。一般情况下，茶树为异花授粉植物，任何杂交获得的亲本都可以为遗传作图提供足够的DNA多态性[29]，除非常相近个体外。当构建茶树遗传图谱时，尽量选择DNA多态性好与亲缘关系远的材料作为亲本。

3.2 增加分离群体个数

扩大分离群体的方式目前有两种：一是为达到高精度数量性状定位的要求，作图的分离群体采用200～300个；二是可先随机选择一个小群体构建出框架图，再进行部分加密，以获得较为理想的遗传图谱。

3.3 分子标记系统的整合和开发

当前所采用的分子标记技术大部分为RAPD、SSR和AFLP。其中RAPD、AFLP为显性标记，较少单独使用。其中SSR在基因组中广泛分布，常被用于遗传图谱的构建[29-30]，且具有共显性、多态性高、重现性好、易检测等特点，其串联重复的核心序列为1～6 bp[31-32]，Adams等首次提出表达序列标签（ESTs），是指从cDNA文库中随机挑选的克隆进行5′或3′端测序后得到长为150～500 bp的部分cDNA序列[33]。近年来，以表达序列标签为基础开展的茶树基因鉴定、物种遗传演化等研究成效显著[34]。金基强等在1589条茶树的表达序列标签中，发掘出分布于346条表达序列标签中的281个基因编码区的简单重复序列[35]；Zhao等从2119条茶树表达序列标签中，找到出现频率为6.8%的180个基因编码区的简单重复序列[36]。因此现在茶树遗传图谱研究工作的重点，是寻找可以检测多个等位位点的共显性标记和找到直接来源于基因表达序列的等位基因。

3.4 研究适合茶树自身特点的方法和作图理论

作图时如果采用有亲缘关系物种的杂交二代或“双假测交”的方法将会丢失大量的遗传信息，导致图谱精确度大大降低。由于茶树基因型高度杂合，且自交不亲和，可用于连锁分析的子代分离类型达到7种，可配成17种不同的分离类型对[37]。所以研究适合茶树自身特点的方法和作图理论，提高遗传信息的使用效率对构建高密度茶树遗传图谱十分重要。

3.5 开展比较作图研究

通过比较作图，对于某物种遗传图谱上已定位的新基因，为了大大提高基因定位的效率，可选择在其亲缘关系近的物种的染色体同源区段定位相同的基因。比较作图揭示了物种基因组间的同源性和差异性，也为物种起源及遗传演化研究提供了新的依据，而且各物种中可供利用的遗传标记数量显著增加[38]。因此，选择合适的DNA标记开展比较作图，也是未来茶树遗传图谱研究发展的一个重要趋势。

综上，虽然对茶树的遗传图谱研究比较滞后，现在得到的遗传图谱精密度也不高，构建方法也尚不完善，但是随着理论和技术的不断创新，茶树遗传图谱的研究必将有新的发展。构建遗传图谱为提高茶树的育种效率。建立高密度的茶树分子遗传图谱，定位和目标性状紧密连锁的分子标记，有利于在茶树生长发育初期选择群体中含有目标基因的植株，推动育种工作和其他应用的顺利进展。

[1] 陈宗憋,杨亚军.中国茶经[M].上海文化出版社，2011.

[2] 湖南农业大学.茶树育种学 (第二版) [M].北京：中国农业出版社 , 1999 .

[3] Edwards MD, Helentjaris T, Wright S, et al. Molecular-markerfacilitated investigations of quantitative trait loci in maize[J]. Theor Appl Genet, 1992, 83 (6/7)： 765-744.

[4] Michelmore RW, Paran I, Kesseli RV. Identif cation of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis：A rapid method to detect markers in speci f c genomic regions by using segregating populations[J]. Proc Natl Acad. Sci USA, 1991, 88(21)： 9828-9832.

[5] Song K, Slocum MK, Osborn TC. Molecular marker analysis of genes controlling morphological variation in Brassica rapa (syn. campestris)[J]. Theor Appl Genet, 1995, 90(1)： 1-10.

[6] 沈利爽, 朱立煌. 植物的比较基因组研究和大遗传系统[J].生物工程进展, 1995, 15(2)： 23-28.

[7] Donis-Keller H, Green P, Helms C, et al. A genetic linkage map of the human genome[J]. Cell, 1987, 51(2)： 319-337.

[8] Murray JC, Buetow KH, Weber JL, et al. A comprehensive human linkage map with centimorgan density[J]. Science, 1994, 265(5181)： 2049-2054.

[9] Zimdahl H, Nyakatura G, Brandt P, et al. A SNP map of the rat genome generated from cDNA sequences[J]. Science, 2004, 303(5659)： 807.

[10] Moen T, Hayes B, Baranski M, et al. A linkage map of the Atlantic salmon (Salmo salar) based on EST-derived SNP markers[J]. BMC Genomics, 2008(9)： 223.

[11] Bohn M, Khairallah MM, González-de-León D, et al. QTL mapping in tropical maize： I. Genomic regions af fecting leaf feeding resistance to sugarcane borer and other traits[J]. Crop Sci, 1996(36)： 1352-1361.

[12] Weeden N F, Hemmat M, Lawson D M, et al. Development and application of molecular marker linkage maps in woody fruit crops. Euphytica, 1994, 77： 71-75.

[13] Taniguchi F, Tanaka J, Kono I, et al. Construction of genetic linkage map of tea using SSR markers[C]//The Organization Committee of the 2007 ICOS. Proceedings of the 3rd International Conference on O-Cha (tea) Culture and Science(ICOS). Shizuoka： The Organization Committee of the 2007 ICOS, 2007.

[14] Brondani RP, Williams ER, Brondani C, et al. A microsatellitebased consensus linkage map for species of Eucalyptus and a novel set of 230 microsatellite markers for the genus[J]. BMC Plant Biol, 2006(6)： 20.

[15] Doucleff M, Jin Y, Gao F, et al. A genetic linkage map of grape, utilizing Vitis rupestris and Vitis arizonica[J]. Theor Appl Genet, 2004, 109(6)： 1178-1187.

[16] 田中淳一. RAPD をべースにしたチャの连锁地图の作成と遗传解析への利用の可能性[J]. 茶業研究報告, 1996,84(别册)： 44-45.

[17] Hackett CA, Wachira FN, Paul S, et al.Construction of a genetic linkage map for Camellia sinensis(tea)[J]. Heredity,2000, 85(4)：346-355.

[18] 黄建安,李家贤,黄意欢,等.茶树AFLP分子连锁图谱的构建[J].茶叶科学,2005,25(1)： 7-15.

[19] 黄福平，梁月荣，陆建良，等.应用RAPD和ISSR分子标记构建茶树回交1代部分遗传图谱[J].茶叶科学, 2006, 26(3)： 171-176.

[20] Kamunya SM, Wachira FN, Pathak RS, Korir R, Sharma V, Kumar R, Bhardwaj P, Chalo R, Ahuja PS, Sharma RK. Genomic mapping and testing for quantitative trait loci in tea (Camellia sinensis (L.)O. Kuntze), Tree Genetics&Genomes, 2010, 6(6), 915-929

[21] 马建强，姚明哲，陈亮.茶树遗传图谱研究进展[J].茶叶科学，2010,30(5)：329-335.

[22] Hu CY, Lee TC, Tsai HT, Tsai YZ, Lin SF. Construction of an integrated genetic map based on maternal and paternal lineages of tea (Camellia sinensis) [J]. Euphytica, 2013, 191(1)：141-152.

[23] 马建强. 茶树高密度遗传图谱构建及重要性状QTL定位[D]. 北京：中国农业科学院博士学位论文, 2013.

[24] Zamir D, Tadmor Y. Unequal segregation of molecular genes in plants[J]. Bot Gaz, 1986(147)： 355-358.

[25] 方宣钧，吴为人，唐纪良.作物DNA标记辅助育种[M].北京：科学出版社，2000.

[26] Paterson AH, De Verna JW, Lanini B, et al. Fine mapping of quantitative trait loci using selected overlapping recombinant chromosomes in an interspecies cross of tomato[J]. Genetics, 1990, 124(3)： 735-742.

[27] Strauss SH, Lande R, Namkoong G. Limitation of molecular marker aided selection in forest tree beeding[J]. Can J Forest Res, 1992, 22(7)：1050-1061.

[28] Costa P, Pot D, Dubos C, et al. A genetic map of Maritime pine based on AFLP, RAPD and protein markers[J]. Theor Appl Genet, 2000(100)： 39-48.

[29] Hearnden PR, Eckermann PJ, McMichael GL, et al. A genetic map of 1000 SSR and DArT markers in a wide barley cross[J]. Theor Appl Genet, 2007, 115(3)： 383-391.

[30] Shimoda N, Knapik EW, Ziniti J, et al. Zebra f sh genetic map with 2000 microsatellite markers[J]. Genomics, 1999, 58(3)：219-232.

[31] Litt M, Luty JA. Hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplif cation of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene[J]. Am J Hum Genet, 1989, 44(3)： 397-401. [32] Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers[J]. Nucleic Acids Res, 1989, 17(16)： 6463-6471.

[33] Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, et al. Complementary DNA sequencing： expressed sequence tags and human genome project[J]. Science, 1991, 252(5013)： 1651-1656.

[34] Chen L, Zhao LP, Ma CL, et al. Recent progress in the molecular biology of tea (Camellia sinensis) based on the expressed sequence tag strategy：a review[J]. J Hortic Sci Biotech, 2009, 84(5)： 476-482.

[35] 金基强, 崔海瑞, 陈文岳, 等. 茶树 EST-SSR 的信息分析与标记建立[J]. 茶叶科学, 2006, 26(1)：17-23.

[36] Zhao LP, Liu Z, Chen L, et al. Generation and characterization of 24 novel EST derived microsatellites from tea plant (Camellia sinensis) and cross-species ampli f cation in its closely related species and varieties[J]. Conserv Genet, 2008, 9(5)：1327-1331.

[37] Maliepaard C, Jansen J, Van Ooijen JW. Linkage analysis in a full-sib family of an outbreeding plant specie：overview and consequences for applications[J]. Genet Res,1997(70)： 237-250.

[38] Devos KM, Gale MD. Genome relationships：the grass model in current research[J]. Plant Cell, 2000(12)： 637-646.

Research Progress in Genetic Map of Tea Plant (Camellia sinensis)

SHI Yu-lan，ZHENG Chu-chu，CHEN Si，OU Shu-qiong，PENG Jing，WANG Kun-bo*
（Tea science ministry of education key laboratory of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

Genetic maps are important tools in plant genomics and breeding. In this paper, the construction procedure of genetic mapping and research progress in genetic map of tea plant were introduced. Therefore, we proposed improved strategies for the construction of genetic map of tea plant.

Camellia sinensis, Genetic map, Molecular markers

S571.1

A

1009-525X（2017）02-03-07

2017-04-21

2017-06-15

国家自然科学基金项目（31470692、31670691和31500567）

石玉兰（1993-），女，湖南邵阳人，在读硕士研究生，研究方向：茶叶生物化学。

*通讯作者：王坤波（1976-），男，湖北十堰人，教授，主要从事茶叶功能成分化学和茶树次生代谢调控的研究。Email：wkboo163@163.com