基于代谢组学的麻黄细辛附子汤治疗流感小鼠的作用机制研究

孙启慧+张静+李壮壮+杜宝香+蒋海强+杨勇+吕青涛+容蓉

[摘要] 該研究运用代谢组学方法，研究麻黄细辛附子汤（MXF）干预的流感小鼠血清中内源性代谢物的变化，寻找潜在生物标志物及相关的代谢通路，探讨MXF的药效及作用机制。实验选用昆明（KM）小鼠36只，随机分为正常组、流感组、MXF组，使用流感病毒H1N1滴鼻感染，建立流感小鼠模型；MXF组使用药物干预，其他组给予等体积的生理盐水，每日1次，连续6 d，记录小鼠的体重、肛温等药理指标，末次给药24 h后收集血清样本，采用HPLC-TOF-MS检测。结果显示，与正常组相比，流感组小鼠体重、肛温均出现不同程度下降，肺指数和死亡率明显升高（P<0.05），MXF组各药理指标出现良好的回调趋势；血清样本采集的原始数据，使用R语言，MPP，SIMCA-P等软件进行处理，发现3组小鼠血清中14种内源性物质发生显著性变化（P<0.05），经MXF干预后代谢物水平均出现不同程度的回调；进一步利用MetPA数据平台分析发现，14种代谢物涉及的通路包括糖代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂和鞘脂代谢等。通过对这些差异性代谢物生理功能的分析，并结合测定的宏观药理指标的分析，推测MXF可能从改善糖代谢，调节花生四烯酸代谢、甘油磷脂和鞘脂代谢等多途径，发挥其药效作用。

[关键词] 代谢组学； 流感小鼠模型； 麻黄细辛附子汤； 潜在生物标志物

[Abstract] This study aimed to analyze the endogenous metabolite changes in the serum of mice infected with H1N1 virus after intervention by Mahuang-Xixin-Fuzi decoction （MXF） based on metabolomics method， investigate potential biomarkers and related metabolic pathways， and explore the therapeutic mechanism of MXF through metabolomics technology. Thirty-six Kunming （KM） mice were randomly divided into three groups： normal group， model group and MXF group. Influenza virus H1N1 was used by nasal drip to establish influenza mice model. The mice in MXF group were orally administrated with MXF for 6 consecutive days after inoculation， and the other two groups were given with equal volume of saline solution in the same way. Body weight， rectal temperature， morbidity and mortality were recorded daily. Serum samples were collected 24 hours after the last administration for HPLC-TOF-MS analysis. The results showed that as compared with the normal group， the body weight and rectal temperature were decreased in model group， and their lung index and mortality rate were significantly increased （P<0.05）； MXF had good therapeutic effects on the abnormity of body weight， rectal temperature， lung index and high mortality rate of mice infected with H1N1 virus. The original data collected from the serum samples were analyzed with R language， MPP， SIMCA-P and other software， and significant changes were found in 14 kinds of endogenous substances from mice serum （P<0.05）. As compared with model group， the potential metabolic markers in MXF group recovered to normal levels to a certain degree after being intervened by MXF. Further analysis with MetPA data platform showed that， the pathways involved in 14 metabolites included glucose metabolism， arachidonic acid metabolism， glycerophospholipids and sphingolipids metabolism etc. The metabolomics study and pharmacological experiment showed that MXF might play a role of efficacy by improving glucose metabolism， regulating arachidonic acid metabolism， glycerophospholipid and sphingolipid metabolic pathways.

[Key words] metabolomics； mice model infected with influenza virus A； Mahuang Xixin Fuzi decoction； potential metabolic markers

代谢组学（metabolomics）是现代系统生物学研究的一个重要方面，于20世纪90年代末期迅速发展起来；主要通过对组群的指标进行分析，对生物体在遗传变异、疾病侵袭、药物干预等内外因素的作用下，其中所包含的内源性小分子代谢物（一般是指相对分子质量小于1 000的物质）种类和数目等变化的动态规律以及与生理、病理变化的关联，进行定性定量分析[1-3]。该方法与中医药学的整体观念相结合，为研究中医证候本质以及中药的整体作用机制提供新的思路和方法[4]。

流感是一种呼吸道传染病，流行性强，波及范围极广，据统计每年全球大约有20%的人感染流感，其中2009年爆发的全球性H1N1甲型流感造成全球至少20万人死亡[5]。流感临床症状较重，具有发病急骤的特点，感染流感后会出现畏寒、发热、头痛、全身无力等症状，有时会同时出现咽喉疼痛、咳嗽等呼吸道方面的症状；另外流感容易出现并发症，严重时可引起患者的死亡[6-7]。“麻黄细辛附子汤”（Mahuang-Xixin-Fuzi decoction， MXF）来源于东汉时期著名医家张仲景《伤寒论》，该方组方严谨，作为经典方剂在临床中应用广泛，后世常用MXF及其加减方剂治疗各种疾病，主要是以温经散寒解表，表里兼治为功用[8-9]。本研究通过比较流感小鼠和MXF干预的流感小鼠血清内源性代谢物变化，拟探究中药复方治疗疾病的方证相关性，以及药物的干预作用，为阐释流感小鼠的生物学本质及MXF对其干预作用机制研究提供依据。

1 材料

Agilent 1260系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱）；Agilent 6230 TOF质谱仪（美国安捷伦公司，配有标准的电喷雾离子源、Mass Hunter Data Acquisition在线工作站和Qualiative Analysis离线分析软件）；智能恒温控制仪（成都泰盟科技有限公司）；ZIL-2 型小鼠自主活动仪（中国医学科学院药物研究所）；01193-YP601N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DW-HL668超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）；3K15通用台式冷冻离心机（德国Sigma公司）；高速离心机（上海医用分析仪器四厂，编号3741）；涡旋仪（Benchmark Scientific Inc.，编号12081354）；乙腈（高效液相色谱纯，Tedia， USA）；甲酸（高效液相色譜纯，Tedia， USA）。

流感病毒H1N1（北京地方株，引自中国 CDC 病毒病研究所）；麻黄、附子、细辛（批号20110501，均购自济南市建联中药有限公司中药饮片厂），经山东中医药大学李峰教授鉴定，分别为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf. 的干燥草质茎，毛莨科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx. 的炮制品，马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.） Kitag. 的干燥根和根茎，均符合《中国药典》2015年版标准。

KM小鼠，体重（20±2） g，SPF级，由山东鲁抗动物实验中心提供，动物许可证号SCXK（鲁） 20080002。

2 方法

2.1 流感小鼠模型的制备

KM小鼠按照体重和肛温随机分成正常组、流感组和MXF组，使用流感病毒H1N1鸡胚尿囊液（血凝滴度为1∶320）滴鼻感染小鼠（50 μL/只），正常组小鼠滴鼻接种等量的生理盐水[10]；第1 天接种流感病毒，第2～7天为药物干预治疗，每天记录小鼠体重、肛温变化，观察小鼠的精神状态、发病及死亡情况。

2.2 给药剂量设计

小鼠给药量按10 mL·kg-1计算，MXF剂量为2.5 g·kg-1·d-1，相当于人临床等效剂量；于感染第2天给药干预，正常组和流感组灌服等体积的蒸馏水，连续给药6 d，每天1次。

2.3 指标观察

造模过程中每天测量接种流感病毒后小鼠的肛温、体重1次，记录每天变化趋势，连续7 d；观察过程中小鼠的临床症状如精神状况、活动度、饮食等变化；计算每组的死亡率：死亡率=死亡动物数/动物总数×100%；实验结束取各组小鼠肺、脾、胸腺等组织，称取脏器质量，计算脏器指数。

2.4 血清样品前处理

精密吸取所处理的正常和模型组样品各200 μL，分别用3倍量乙腈进行沉淀，涡旋5 min，1万 r·min-1高速离心15 min，上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为样品溶液。

2.5 色谱和质谱条件

HALO C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～15 min，15%B，15～20 min，15%～55%B，20～30 min，55%～75%B，30～40 min，75%～95%B，40～45 min，95%～100%B，45～65 min，100%B，流速0.3 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量5 μL。质谱采集选择正离子模式；毛细管电压140 V；质量数扫描范围100～1 000；干燥气温度350 ℃；干燥气流速8 L·min-1；雾化压力30 psi（1 psi=6.895 kPa）；参比离子质荷比m/z 121.050 6，922.009 8。

2.6 数据处理

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）》，进行样品血清代谢物的相似度评价，以便进一步进行各样品中主要成分的分析。相似性越高，重复性越好。

2.6.1 数据采集与多维数据分析 获得的原始数据经Agilent Mass Hunter Workstation（Qualitative Analysis B.06.00）软件进行数据转换，并进行去同位素峰处理。得到的数据导入R软件使用XCMS软件包进行峰对齐和峰积分等处理，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据矩阵，参数设定包括 fwhm=10，bw=10，snthresh=5，其余的参数全部使用默认数值，并采用修正80%规则去除缺失值。再将得到的数据导入SIMCA-P 11.5（Umetrics）处理软件，对数据集进行数据的标度化和中心化处理，采用无监督的主成分分析（PCA）和有监督的偏最小二乘判别分析方法（ partial least square discriminant analysis，PLS-DA） 对数据进行分析，选择投影变量重要性（variable importance for the projection，VIP）>1.5的变量，进行t检验，方差分析（ANOVA）以及对数转换（fold change，FC）分析。本试验将VIP>1.5，P<0.05，FC>1.2的代谢物作为潜在生物标志物。

2.6.2 生物标志物的鉴定及代谢途径的分析 根据模式识别后筛选得到的潜在生物标志物的精确相对分子质量，查询以下代谢产物和质谱数据库：KEGG（http：//www.kegg.com），HMDB（http：//www.hmdb.ca），METLIN（http：//www.metlin.scipps.edu）进行质谱信息匹配，对潜在生物标志物进行初步鉴定。将鉴定得到的标志物导入Metpa数据库，进行代谢通路的关联和分析。

3 结果

3.1 体重肛温

正常组小鼠的体重有升有降，但总体呈上升趋势；流感组小鼠体重呈现持续下降趋势；MXF组给药干预第1 天体重呈降低趋势，第2～6天体重逐渐上升，说明MXF对流感小鼠体重回升具有一定的积极作用，结果见表1。正常组小鼠的肛温高于其他组，流感组小鼠肛温在药物干预的第5，6 天明显低于正常组（P<0.01），MXF组小鼠肛温在药物干预后不断上升，与正常组没有显著性差异，在药物干预的第6天明显高于流感组小鼠的肛温（P<0.01），结果见表2。

3.2 死亡率、肺指数

死亡率和肺指数是2项重要的药理检测指标，结果显示，正常组和MXF组小鼠均无死亡现象，流感组死亡率为8.3%，MXF具有明显降低小鼠死亡率的趋势（P<0.01）；流感组小鼠的肺指数明显高于正常组（P<0.05），经MXF干预后流感小鼠的肺指数降低且与正常组无显著性差异，结果见表3，图1。

3.3 脏器指数

与正常组相比，流感组小鼠的脾指数，睾丸指数和精囊腺指数均明显降低（P<0.05），MXF干预组小鼠的脾、胸腺、肾、精囊腺等脏器指数出现明显回升，与正常组无显著性差异，并且脾指数已经基本恢复至正常水平，与流感小鼠相比出现显著性差异（P<0.05），结果见表4。

3.4 数据处理结果

3.4.1 方法学考察结果 采用《中药色谱指纹图和精囊腺指数均明显降低（P<0.05），MXF干预组小鼠的脾、胸腺、肾、精囊腺等脏器指数出现明显回升，与正常组无显著性差异，并且脾指数已经基本恢复至正常水平，与流感小鼠相比出现显著性差异（P<0.05），结果见表4。

3.4 数据处理结果

3.4.1 方法学考察结果 采用《中药色谱指纹图血清代谢组学数据的S-Plot-VIP图，通过loading图和S-Plot-VIP图，可以得到不同组间差异性较大的物质，见图6，7。图6，7中偏离中心（原点）越远的点，表示该物质在不同组间差异越大，即可能为不同组间潜在的生物标志物。

3.4.5 潜在生物标志物的鉴定 通过PLS-DA，t检验，方差分析（ANOVA）以及对数转换分析，选取VIP>1.5，P<0.05，FC>1.2的差异性变量；根据变量的保留时间和精确质核比在HMDB，METLIN，KEGG数据库中检索潜在生物标志物。其中正常组和流感组中鉴定了13个潜在生物标志物；正常组、流感组和MXF组中鉴定了14个潜在生物标志物；主要涉及花生四烯酸代谢，亚油酸代谢，甘油磷脂和鞘脂代谢以及能量代谢等代谢通路，见表5，6。

3.4.6 MetPA代谢通路分析 MetPA（metabolomics pathway analysis）是基于网络、易于使用、全功能的代谢路径分析工具，它结合先进的通路富集分析与拓扑分析，能够帮助研究者找出实验结果中最可能的相关代谢通路。因此，将得到的差异性潜在标志物输入MetPA平台，分析正常外感模型造模后血清中差异性潜在标志物的代谢通路。很多代谢物会涉及到多条代谢通路，这就意味着代谢通路分析方法对于代谢组学实验中的生物学解释具有很好的优势，结果见图8。

4 讨论

葡萄糖一直被认为是机体生命活动所依赖的主要能源物质，研究发现[14-15]，当机体过度消耗葡萄糖用于能量供应时，血周葡萄糖浓度会急剧降低，而乳酸的濃度会显著升高，用于提供能量；流感模型组小鼠血清中，D-葡萄糖含量下降，乳酸含量升高，推测是由于感染病毒后小鼠体内病毒大量复制消耗能量所致。另外，模型组小鼠血清中苯丙氨酸的含量升高，该物质能够促进肠道激素释放肠促胰肽酶（CCK），从而产生饱感而抑制食欲，最终减少能量的摄入[16]；模型组小鼠日常饮食的摄入量会减少，体重降低，可能是由于小鼠血清中苯丙氨酸含量升高，食欲减弱造成。以上实验结果显示，H1N1感染的流感小鼠与糖代谢和氨基酸代谢关系密切；中药MXF干预后，小鼠血清中D-葡萄糖，乳酸以及苯丙氨酸均出现不同程度的回调，推测该药物通过调节糖代谢和氨基酸代谢途径，起到对流感的干预作用。

炎症是机体对组织损伤或致病因子侵入所发生的防御反应[17]，花生四烯酸在炎症和免疫反应中起到重要的调节作用，该物质一般由油酸、亚油酸等转化而来，主要以磷脂的形式存在于生物膜上[18]，与许多疾病的代谢有密切关系。该物质可通过环氧化酶途径和脂氧化酶途径代谢为前列腺素（prostaglandins，PGs）、血栓素（thromboxane，TXs） 等代谢物[19-20]。本实验中，模型组小鼠感染H1N1，肺部炎症明显，肺指数明显升高，同时研究发现模型小鼠血清中油酸，亚油酸，二十碳五烯酸以及血栓素等物质代谢异常；经中药MXF干预后小鼠肺指数与正常组没有显著性差异，肺组织修复良好，并且上述物质代谢趋于正常水平，提示花生四烯酸代谢通路是MXF干预流感的作用通路之一。

H1N1病毒感染会导致呼吸道黏膜水肿和肺部炎症反应，引起炎性介质释放[21]，从而激活细胞膜上的磷脂酶A2，使甘油磷脂水解，产生溶血卵磷脂（LPC）、溶血脑磷脂及花生四烯酸等[22-23]，其中LPC类物质能与蛋白共同组成肺泡表面的免疫活性物质，有助于控制机体炎性反应发生和肺部感染[24]。本实验发现，模型小鼠血清中LPC含量显著上升，MXF治疗后LPC类成分趋向正常水平。研究同时发现，流感组小鼠血清中鞘脂代谢通路的主要成分之一鞘氨醇含量显著升高，该研究结果与Lu等[25]对感染H1N1病毒患者的血清代谢组学研究结果相符，MXF治疗后鞘氨醇含量回调。从而推测MXF对H1N1病毒感染的治疗作用，与干预甘油磷脂代谢和鞘脂代谢通路有密切关联。

本研究采用基于HPLC-TOF-MS的代谢组学方法研究了H1N1感染的流感小鼠疾病模型以及中药MXF的干预作用机制。结果显示，采用代谢组学研究方法通过对这些差异性代谢物生理功能的分析，结合测定的宏观药理，推测MXF可能从改善能量代谢、调节花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢等多途径，发挥其药效作用。该方法能较全面地从生物体生理及代谢状态的整体角度探讨中药的作用机制，为阐释中药药效的本质提供了一种手段。

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