黄芩素中有关物质的检测及其降解机制初步研究Δ

王玮珏，董武军，张培成，苏倩倩，范茹涵，刘玉玲#（.中国医学科学院/北京协和医学院药物研究所药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室，北京 00050；.中国医学科学院/北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 00050；.郑州大学药学院，郑州 45000）

黄芩素中有关物质的检测及其降解机制初步研究Δ

王玮珏1＊，董武军1，张培成2，苏倩倩1，范茹涵3，刘玉玲1#（1.中国医学科学院/北京协和医学院药物研究所药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室，北京 100050；2.中国医学科学院/北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050；3.郑州大学药学院，郑州 450001）

目的：建立黄芩素中有关物质的分离检测方法，鉴定其结构并初步探讨降解机制。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）检测黄芩素与合成过程中的有关杂质及强制破坏降解产物：色谱柱为ES Industries®FluoroSep-RP Phenyl，流动相为0.3%甲酸-甲醇-乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为275 nm，柱温为10℃，进样量为10 μL。采用LC-串联质谱法鉴定有关物质并推测降解机制：色谱柱为ES Industries®FluoroSep-RP Phenyl，流动相为0.3%甲酸-甲醇（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为275 nm，柱温为10℃，进样量为10 μL；离子源为电喷雾离子源，正负离子同时检测，雾化器压力为55 psi，干燥气体流速为11 L/min，干燥气体温度为350℃，毛细管电压为4.0 kV，检测模式为全扫描一级质谱和选择离子全扫描二级质谱，扫描范围为m/ z 100～1 000（一级质谱），50～500（二级质谱），电离电压为80～135 eV，碰撞能量为10～30 eV。结果：黄芩素检测质量浓度线性范围为2.4～480 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；定量限、检测限分别为7.2、2.4 ng。黄芩素与有关物质及3个主要降解产物分离良好，有关物质为化学合成前体木蝴蝶素；碱降解产物为6，7位邻醌衍生物和7，8位邻醌衍生物，两者互为异构体；氧化降解产物为苯甲酸苯酯类衍生物。结论：黄芩素碱降解和氧化降解的主要机制包括吡喃环开环、互变重排和氧化反应等；该研究所建方法专属性好、灵敏度高，可用于黄芩素有关物质的分离检测。

黄芩素；有关物质；降解机制；高效液相色谱法；液相色谱-串联质谱法

黄芩素（Baicalein，BE）是黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的主要活性成分之一，分子式为C15H10O5，化学名为5，6，7-三羟基黄酮（5，6，7-Trihydroxyflavone），化学结构见图1。研究表明，黄芩素具有显著的抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝、保护神经元等药理作用[1-4]，含有黄芩素成分的中药制剂在临床上已被广泛用于治疗细菌或病毒引起的急慢性肠炎、痢疾、上呼吸道感染、急慢性结膜炎等。但受溶解度低、化学性质不稳定等理化性质限制，黄芩素单一成分至今未能成药。

图1 黄芩素的化学结构Fig 1 Chemical structure of baicalein

黄芩素属多羟基黄酮，分子结构中含有三个羟基，在溶液状态尤其是碱性条件下极易发生化学降解，降解机制复杂。含有酚羟基的黄酮易被氧化为醌类衍生物，由于降解产物结构的特殊性，且通常为系列降解产物，高效液相色谱法（HPLC）常用的C18、C8、苯基、腈基、氨基等色谱柱往往难以对降解产物进行有效分离与检测。文献采用HPLC考察黄芩素在不同pH的Krebs-Ringer试液中的稳定性，发现在pH 6.0、6.8、7.4条件下药物含量均显著降低，但该报道未对降解产物进行测定[5]。另有文献通过紫外光谱研究光照、温度、pH及抗氧化剂对黄芩素稳定性的影响，发现在光照和碱性条件下黄芩素溶液的吸光度值显著下降，其含量明显降低，但该文献亦未对黄芩素降解产物进行分离检测和结构鉴定[6]。有研究报道了黄芩素原料药有关物质的HPLC分析方法，但最终仅鉴定检测了千层纸素A，未能提供黄芩素的降解情况及降解产物结构信息[7]。本课题组曾参考文献[7]方法对黄芩素有关物质进行考察，发现碱破坏降解产物多、峰形差且堆积在溶剂峰后，难以有效分离，无法满足有关物质测定要求。

虽然普遍认为黄酮类化合物的降解产物多为醌类结构[8-9]，但关于黄芩素的降解产物类型及其结构至今尚不清楚。而关于黄芩素系列降解产物的有效分离与检测，国内外亦均未见文献报道，这在一定程度上影响了黄芩素制剂的开发和临床应用。本课题组以全合成的黄芩素为试验样品，拟通过优化HPLC色谱条件，实现黄芩素与工艺杂质及破坏降解产物的有效分离；并进一步结合二极管阵列（DAD）紫外光谱分析和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）一级、二级质谱信息收集，对降解产物进行结构鉴定，由此推测黄芩素降解机制，为后续的黄芩素制剂研发提供准确、科学的质量控制方法。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪（包括DAD检测器、自动进样器、柱温箱）、1200型LC-6410型三重串联四级杆质谱仪（包括DAD二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源、三重四级杆质谱仪）均购自美国Agilent公司；XS105 Dual Range型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 试剂

黄芩素原料药（中国医学科学院药物研究所自制，批号：HJ73）；黄芩素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111595-200905，纯度：98.5%）；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取黄芩素对照品12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液 精密称取黄芩素原料药12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

2.1.3 强制破坏样品溶液 精密称取黄芩素原料药60 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL，作为贮备液，备用。①酸破坏样品溶液：精密量取上述贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加0.01 mol/L盐酸1 mL，30℃水浴加热30 min，再加甲醇定容，摇匀，即得。②碱破坏样品溶液：精密量取上述贮备液1 mL，置于10 ml量瓶中，加0.01 mol/L氢氧化钠0.5 mL，30℃水浴加热20 min，加0.01 mol/L盐酸0.5 mL中和，再加甲醇定容，摇匀，即得。③氧化破坏样品溶液：精密量取上述贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加10%过氧化氢1 mL，30℃水浴加热30 min，再加甲醇定容，摇匀，即得。④高温破坏样品溶液：精密量取上述贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，置于80℃烘箱中加热24 h，冷却后加甲醇定容，摇匀，即得。⑤光照破坏样品溶液：精密量取上述贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，于（4 500±500）lx强光下照射24 h，再加甲醇定容，摇匀，即得。

2.2 有关物质分离检测

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ES Industries®FluoroSep-RP Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.3%甲酸溶液（A）-甲醇（B）-乙腈（C），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：10℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Program of gradient elution

2.2.2 专属性试验 分别量取“2.1”项下供试品溶液和强制破坏样品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。结果表明，样品在各强制降解条件下产生的主要降解产物与黄芩素分离良好，主要降解产物之间均有效分离，分离度均＞1.5，理论板数均≥10 000，表明本方法专属性良好，能够将降解产物有效分离，满足有关物质测定要求。

2.2.3 线性关系考察 精密称取黄芩素对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为2.4、4.8、24、48、120、240、480 μg/mL的系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以黄芩素质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得黄芩素回归方程为y＝56.42x－24.37（r＝0.999 9）。结果表明，黄芩素检测质量浓度线性范围为2.4～480 μg/mL。

图2 高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms

2.2.4 定量限（LOQ）与检测限（LOD）考察 取“2.2.3”项下质量浓度为24 μg/mL的对照品溶液，逐级稀释，精密量取各级对照品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得LOQ为7.2 ng；当信噪比为3∶1时，得LOD为2.4 ng。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.3”项下质量浓度为240 μg/mL对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，黄芩素峰面积的RSD＝1.4%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液、“2.2.3”项下质量浓度为240 μg/mL对照品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，供试品、对照品溶液中黄芩素峰面积的RSD分别为1.5%、1.4%（n＝5），表明供试品、对照品溶液未产生新的杂质，溶液在8 h内基本稳定。

2.2.7 重复性试验 精密称取黄芩素对照品适量，加甲醇制成含量为100%的供试品溶液，共6份，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，黄芩素峰面积的RSD＝1.3%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.8 样品中杂质的测定 精密称取黄芩素原料药12 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液；精密量取上述供试品溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为对照溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10 μL，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量。结果表明，黄芩素原料药中单个最大杂质的含量为2.08%，总杂质含量为2.37%。

2.2.9 有关物质来源分析及紫外光谱测定 由图2可知，黄芩素强制破坏样品中主要有4个杂质，其保留时间分别为11.5、12.6、15.4、27.0 min，依次命名为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4。在酸破坏和光照破坏条件下，黄芩素未产生明显的降解产物，表明其对酸、光照的稳定性良好；黄芩素在碱破坏和高温破坏条件下主要形成杂质1、杂质2，氧化破坏主要形成杂质3，表明碱、氧化条件对黄芩素稳定性的影响最为显著；在各强制破坏条件下，杂质4的含量均未见明显改变，推测该杂质可能为合成过程中产生的副产物。

取“2.1”项下供试品溶液、强制破坏样品溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件（检测波长为200～400 nm）连续进样测定6次，记录DAD吸收曲线，详见图3。结果，杂质1、杂质2、杂质3的紫外光谱形态和最大吸收均与黄芩素有明显差异，表明其共轭骨架结构与黄芩素不同；而杂质4具有典型的黄酮化合物紫外光谱特征，且与黄芩素相似，表明其化学结构与黄芩素相近。

图3 DAD吸收曲线Fig 3 DAD absorption spectrum

2.3 有关物质结构鉴定及降解机制推测

2.3.1 LC-MS/MS条件 ①色谱条件。色谱柱：ES Industries®FluoroSep-RP Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.3%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：10℃；进样量：10 μL。该色谱条件下获得的色谱与“2.2”项下的HPLC色谱一致性良好。②质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI），正负离子同时检测；雾化器压力：55 psi；干燥气体流速：11 L/min；干燥气体温度：350℃；毛细管电压：4.0 kV；检测模式：全扫描一级质谱（Scan）和选择离子全扫描二级质谱；扫描范围m/z一级质谱100～1 000，二级质谱50～500；电离电压：80～135 eV；碰撞能量：10～30 eV。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Program of gradient elution

2.3.2 结构鉴定和降解机制推测 黄芩素在碱、氧化条件下的降解最为显著，因此分别量取“2.1.3”项下碱破坏、氧化破坏样品溶液各适量，按“2.3.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录色谱、总离子流（TIC），详见图4、图5。

图4 碱破坏样品的图谱Fig 4 Atlas of samples destroyed by alkaline

图5 氧化破坏样品的图谱Fig 5 Atlas of samples destroyed by oxidation

由图4、图5可知，在LC-MS/MS系统中，黄芩素主峰及主要杂质的保留时间、出峰顺序与HPLC系统基本一致。通过TIC图提取与杂质1～4对应的一级质谱和二级碎片信息，鉴定杂质结构并分析降解机制。各杂质的一级、二级质谱分别见图6、图7。

杂质1和杂质2的一级质谱高度相似（如图6A和B所示），均可观察到m/z 171、210、241、267[M-H-H2O]－、285[M-H]－，可知杂质1、杂质2的分子量为286。杂质1和杂质2的母离子（m/z 285）产生的二级碎片（-ESI）分别如图7A和B所示，由285[M-H]－脱去H2O产生碎片m/z 267，再脱去CO产生m/z 239，碎片质量数和相对丰度基本相同，故推测二者是同分异构体。黄芩素的分子量为270，此分子量286比黄芩素多16，可能是1个氧原子，结合DAD吸收曲线可知，二者的紫外光谱只有一个吸收峰，表明不具有黄酮母体共轭结构，杂质1和杂质2可能的结构、裂解途径见图8。由于化合物的保留时间与极性相关，在反相HPLC中杂质2的保留时间比杂质1大，表明杂质2的极性较小，推测杂质2是分子偶极较小的7，8位邻醌式结构，而杂质1是分子偶极较大的6，7位邻醌式结构，二者是一对异构体。

图6 杂质的一级质谱图Fig 6 First-order MS of impurities

图7 杂质的二级质谱图Fig 7 Second-order MS of impurities

图8 黄芩素碱降解机制及杂质1、杂质2的结构、裂解途径Fig 8 Alkaline degradation mechanism of baicalein and structures and fragmentation pathways of impurity 1，impurity 2

杂质1和杂质2是黄芩素的碱降解产物，据此推测碱降解机制为在碱性条件下，黄芩素C环发生开环反应，产生类似查尔酮的中间结构，通过Wessely-Moser重排反应[10，11]生成互变异构体，同时A环羟基在空气中氧的作用下氧化成醌，生成杂质1和杂质2。

杂质3的一级质谱（+ESI）如图6 C所示，可观察到m/z 247[M+H]+、269[M+Na]+，故分子量为246。杂质3母离子（m/z 247）的二级碎片如图7 C所示，由m/z 247脱去H2O产生碎片m/z 229，再依次脱去CO产生碎片m/z 201 [M+H-H2O-CO]+和m/z 173[M+H-H2O-2CO]+。杂质3的DAD吸收曲线有2个吸收峰，与黄芩素相比，其最大吸收波长发生蓝移，表明杂质3共轭链缩短，可能不具有黄酮母核结构，其可能的结构和裂解过程见图9。

图9 黄芩素氧化降解机制及杂质3的结构、裂解途径Fig 9 Oxidative degradation mechanism of baicalein and structure and fragmentation pathway of impurity 3

杂质3由黄芩素氧化降解产生，推测氧化降解机制为在过氧化氢作用下，黄芩素的C环发生开环反应，A环脱去羟基，2，3位碳-碳双键被氧化，产生苯甲酸苯酯类产物。

杂质4的一级质谱（+ESI）如图6D所示，可观察到m/z 285[M+H]+、307[M+Na]+，故分子量为284；其母离子（m/z 285）的二级质谱如图7D所示，由m/z 285脱去CH3产生m/z 270，再通过逆狄尔斯-阿德尔反应（RDA）裂解产生m/z 168，m/z 168丢失CO产生碎片离子m/z 140，因此可确定杂质4含有甲氧基[12]，推测为黄芩素A环羟基被甲氧基取代的黄酮类化合物；杂质4的紫外吸收光谱与文献报道的木蝴蝶素一致[13]，结合原料药合成工艺路线[14]，推测杂质4是黄芩素的化学合成前体——木蝴蝶素，其结构及可能的裂解过程见图10。

图10 杂质4的结构、裂解途径Fig 10 Structure and fragmentation pathway of impurity 4

3 讨论

黄酮类化合物化学降解机制复杂，采用不同降解条件所得的产物不同，鉴定降解产物的结构困难，文献报道黄芩素易被氧化为醌类衍生物而显绿色[15]，但黄芩素在不同条件下降解所得的产物结构和降解机制至今尚不清楚。本研究通过HPLC-DAD、LC-MS/MS对黄芩素强制降解产物进行分析和结构鉴定，并以此推测其降解机制，结果表明：（1）在碱性条件下，黄芩素吡喃环发生开环反应，经Wessely-Moser反应互变重排成异构体，同时A环酚羟基经空气氧化，降解产生6，7位邻醌类结构（杂质1）和7，8位邻醌类结构（杂质2），两者为互变异构体。（2）在氧化条件下，黄芩素吡喃环发生开环反应，2，3位双键在过氧化氢作用下氧化断裂，产生苯甲酸苯酯类结构（杂质3）。

本研究在HPLC法色谱条件优化中，考察了不同键合相填料的色谱柱，包括C18、C8、苯基、腈基、氨基、苯基己基和氟苯基柱，以及不同柱温（10～40℃）对分离检测结果的影响。结果发现，含苯基键合相的色谱柱及低温有利于降解产物分离，不仅实现了主成分与工艺杂质及降解产物的分离，还实现了醌类降解产物及其互变异构体的相互分离；而其他色谱填料，黄芩素碱降解产物易堆积在溶剂峰后且峰形较差。推测原因，可能是由于醌类降解产物及其互变异构体的化学结构和分子极性都极为相近，而氟苯基色谱柱同时具有疏水作用、π-π电子相互作用及偶极诱导作用，对芳香和杂环化合物、共轭体系及异构体等产生独特的分离机制，更有利于降解产物分离。因此，最终采用FluoroSep-RP Phenyl（FSP）氟苯基色谱柱，在柱温10℃进行有关物质检测分离。

本研究建立的HPLC法，能够有效分离检测黄芩素合成过程中的工艺杂质及系列降解产物，在此基础上，对其主要降解产物进行了结构鉴定，推测了其降解机制。研究结果不仅为黄芩素制备工艺优化及质量控制提供了重要分析方法，同时对黄酮类化合物的有关物质及降解机制研究具有一定指导意义。

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Detection of Related Substances and Preliminary Study on the Degradation Mechanism of Baicalein

WANG Weijue1，DONG Wujun1，ZHANG Peicheng2，SU Qianqian1，FAN Ruhan3，LIU Yuling1（1.Beijing Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulation，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；2.State Key Laboratory of Bioactive Substances and Function of Natural Medicines，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences/ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；3.School of Pharmacy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the separation and detection of related substances in baicalein，identify itsstructure and preliminarily explore the degradation mechanism.METHODS：HPLC was adopted to detect the baicalein，related impurities and forced destruction of degradation products in synthesis process：the column was ES Industries®FluoroSep-RP Phenyl with mobile phase of 0.3%formic acid-methanol-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 275 nm，the column temperature was 10℃，and the injection volume was 10 μL.LC-MS/MS was conducted to identify the related substances and conjecture degradation mechanism：the column was ES Industries®FluoroSep-RP Phenyl with mobile phase of 0.3% formic acid-methanol（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 275 nm，column temperature was 10℃，and the injection volume was 10 μL；ion source was electrospray ion source，positive and negative ions，nebulizer pressure was 55 psi and the drying gas flow was 11 L/min，drying gas temperature was 350℃，capillary voltage was 4.0 kV，detection modes were full-scan first-order MS and selective ion full-scan second-order MS，scan ranges were m/z 100-1 000（first-order MS）and 50-500（second-order MS），ionization voltage was 80-135 eV，and the collision energy was 10-30 eV.RESULTS：The linear range of baicalein was 2.4-480 μg/mL（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the limit of quantitation was 7.2 ng，the limit of detection was 2.4 ng.Baicalein was well separated with related substance and 3 major degradation products，the related substance was chemical synthesis precursor wood butterfly；the degradation products were 6，7-quinone derivatives and 7，8-quinone derivatives，which were isomers；oxidative degradation products were benzoic acid phenyl ester derivatives.CONCLUSIONS：The main mechanisms of alkali degradation and oxidative degradation of baicalein include pyran，reciprocal rearrangement and oxidation reaction；the established method is specific and sensitive，and can be used for the detection of related substances in baicalein.

Baicalein；Related substance；Degradation mechanism；HPLC；LC-MS/MS

R927

A

1001-0408（2017）06-0803-06

2016-04-27

2016-06-30）

（编辑：张 静）

“重大新药创制”科技重大专项（No.2012ZX09301002-001-008）；中央高校基本科研业务费专项“创新药物发现与新技术专项”（No.2012CHX03）

＊硕士研究生。研究方向：纳米给药系统。电话：010-83160332。E-mail：doggiejue@163.com

#通信作者：研究员，博士生导师。研究方向：新型微粒载体构建及肿瘤靶向制剂等。电话：010-63159373。E-mail：ylliu@imm.ac.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.23