RP-HPLC法测定新扶正除疫颗粒中红景天苷和虎杖苷的含量Δ

付美丽，严铭铭，邵 帅，吴程彦，刘 畅，田 双，尉忠贤，杨 洋（长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，长春 130117）

RP-HPLC法测定新扶正除疫颗粒中红景天苷和虎杖苷的含量Δ

付美丽＊，严铭铭#，邵 帅，吴程彦，刘 畅，田 双，尉忠贤，杨 洋（长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，长春 130117）

目的：建立测定新扶正除疫颗粒中红景天苷和虎杖苷含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为GRACE Alltima TMC 18，流动相为甲醇-水（15∶85，V/V，红景天苷）、乙腈-水（23∶77，V/V，虎杖苷），流速为1.0 mL/min，检测波长为275 nm（红景天苷）、306 nm（虎杖苷），柱温为25℃，进样量为10 μL。结果：红景天苷和虎杖苷检测进样量线性范围分别为0.99～10.89 μg（r＝0.999 8）、0.046～1.196 μg（r＝0.999 8）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为96.31%～99.44%（RSD＝1.20%，n＝6）、95.96%～99.73%（RSD＝1.42%，n＝6）。结论：该方法操作简单方便、结果准确可靠，适用于测定新扶正除疫颗粒中红景天苷和虎杖苷的含量。

反相高效液相色谱法；新扶正除疫颗粒；红景天苷；虎杖苷；含量测定

新扶正除疫颗粒原始剂型为汤剂，即扶正除疫汤，因其使用不便，本课题组对剂型进行了改造，制备了新扶正除疫颗粒。该制剂由红景天、虎杖、大青叶、贯众等中药材组成，具有扶正祛邪、清热透毒之功效；方中以红景天为君，解毒达邪，先证用药；以虎杖、大青叶为臣，清热解毒、截断病势，结合贯众的佐使之力，从而达到整体调节、多靶治疗的目的，有效地阻断多个病理环节的恶性循环[1-4]。为了更好地控制新扶正除疫颗粒的质量，本课题组参考相关文献[5]，采用反相高效液相色谱法（RPHPLC）测定新扶正除疫颗粒中红景天苷和虎杖苷的含量，以期为该制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括紫外检测器（美国Agilent公司）；AB265-S型、ALB-224型万分之一分析天平均购自奥豪斯仪器（上海）有限公司；KQ-250B型超声波清洗器（功率：250 W；频率：40 kHz）。

1.2 药品与试剂

新扶正除疫颗粒（长春中医药大学自制，批号：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305，规格：10 g/袋）；红景天苷对照品（批号：111920-201001，纯度：99.8%）、虎杖苷对照品（批号：111575-200502，纯度：100%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，无水乙醇、甲醇为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 红景天苷的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：GRACE Alltima TMC 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液的制备 ①对照品溶液。精密称取红景天苷对照品9.9 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制备每1 mL含红景天苷1.98 mg的对照品贮备液。取上述贮备液适量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制备每1 mL含红景天苷0.48 mg的对照品溶液。②供试品溶液。取样品适量，研细，精密称取细粉1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加甲醇10 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷；再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[6]。③阴性对照溶液。按样品的处方比例和制备工艺，制备不含红景天苷的阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液[7]。

2.1.3 系统适用性试验 精密量取“2.1.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以红景天苷峰计≥2 000，保留时间为18.656 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

龙血树(Dracaena cambodian)属于百合科龙血树属，树叶为线状披针形，簇生于枝条顶端，树形极具特点，可塑性强，可以根据人的意愿塑造出不同形状，树干古朴沧桑，同时还能在顶部萌发新枝，给人一种沉稳而不失朝气的感觉，且十分耐阴，可在室内盆栽多年仍然绿意盎然，是园林绿化及家庭盆栽的名贵树种，具有很好的观赏价值。同时药用价值极高，具有止血、生肌、行气等功效。

图1 红景天苷高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of salidroside

2.1.4 线性关系考察 取“2.1.2”项下对照品贮备液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.1 mL，分别置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成质量浓度分别为0.099、0.198、0.396、0.594、0.792、0.990、1.089 mg/mL的系列对照品溶液。取上述对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得红景天苷的回归方程为y＝308.3x－42.301（r＝0.999 8）。结果表明，红景天苷检测进样量线性范围为0.99～10.89 μg。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（批号：20140302）10µL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，红景天苷峰面积的RSD＝0.42%（n＝12），表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一批供试品溶液（批号：20140304）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，红景天苷峰面积的RSD＝1.43%（n＝7），表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取样品（批号：20140303）适量，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，红景天苷的平均含量为0.41%，RSD＝0.86%（n＝6），表明本方法重复性良好[8-9]。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（批号：20140305）适量，精密加入一定质量的红景天苷对照品，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 红景天苷加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of salidroside（n＝6）

2.1.9 样品含量测定 取5批样品各适量，分别按“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算红景天苷的含量。结果，5批样品（批号：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305）中红景天苷的含量分别为6.675‰、5.354‰、4.893‰、3.464‰、4.183‰（n＝3）。

2.2 虎杖苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：GRACE Alltima TMC 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（23∶77，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：306 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液的制备 ①对照品溶液。精密称取虎杖苷对照品9.2 mg，置于50 mL量瓶中，加稀乙醇（取乙醇529 mL，加水稀释至1 000 mL，即得稀乙醇溶液）溶解并定容，制备每1 mL含0.184 mg的对照品贮备液。取上述贮备液适量，置于100 mL量瓶中，加稀乙醇定容，制备每1 mL含虎杖苷0.03 mg的对照品溶液（避光放置）。②供试品溶液。取样品适量，研细，取约0.25 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加稀乙醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷；再次称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得（避光放置）。③阴性对照溶液。按样品的处方比例和制备工艺，制备不含虎杖苷的阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.2.3 系统适用性试验 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。由图2可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5，理论板数以虎杖苷峰计≥3 000，保留时间为11.452 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图2 虎杖苷高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of polydatin

2.2.4 线性关系考察 取“2.2.2”项下对照品贮备液0.25、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，加稀乙醇定容，摇匀，制成质量浓度分别为0.004 6、0.009 2、0.027 6、0.046 0、0.064 4、0.082 8、0.101 2、0.119 6 mg/mL的系列对照品溶液。取上述对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得虎杖苷的回归方程为y＝308.3x－42.301（r＝0.999 8）。结果表明，虎杖苷检测进样量线性范围为0.046～1.196 μg。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20140302）10µL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，虎杖苷峰面积的RSD＝1.21%（n＝12），表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一批供试品溶液（批号：20140304）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，虎杖苷峰面积的RSD＝0.70%（n＝7），表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取样品（批号：20140303）适量，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，虎杖苷的平均含量为0.75%，RSD＝1.22%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（批号：20140305）适量，精密加入一定质量的虎杖苷对照品，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.2.9 样品含量测定 取5批样品各适量，分别按

表2 虎杖苷加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of polydatin（n＝6）

“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算虎杖苷的含量。结果，5批样品（批号：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305）中虎杖苷的含量分别为2.891‰、7.898‰、0.947‰、11.247‰、5.332‰（n＝3）。

3 讨论

3.1 流动相的选择

本课题组参考了相关文献中红景天苷的流动相：乙腈-水-磷酸[10]、乙腈-水[11]、甲醇-水[12]；虎杖苷的流动相：乙腈-水[13]、乙腈-0.5%乙酸、乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃[14]、甲醇-乙腈-0.1%甲酸[15]，结果，测定红景天苷时以甲醇-水为流动相、测定虎杖苷时以乙腈-水为流动相的分离效果最好，并且柱效最高。因此，本试验选择甲醇-水（红景天苷）、乙腈-水（虎杖苷）为流动相。

3.2 样品提取方法的选择

在提取方法的选择上，本课题组分别用回流法、索氏回流法、超声法对样品中红景天苷和虎杖苷进行提取。结果，采用回流法、索氏回流法、超声法制备的供试品溶液所测得的待测成分含量相差不大，以超声法测得待测成分的含量最高，且超声法操作简便，故两种成分均选择超声法提取。

3.3 样品提取溶剂的选择

在提取溶剂的选择上，课题组考察了甲醇、70%乙醇、水（红景天苷），甲醇、稀乙醇、70%乙醇-乙酸乙酯（3∶1，V/V）（虎杖苷）。结果，红景天苷以甲醇、虎杖苷以稀乙醇为溶剂时经超声法提取最充分，且含量均较高。因此，本试验选择甲醇（红景天苷）、稀乙醇（虎杖苷）为提取溶剂。

综上所述，本方法操作简单方便、结果准确可靠，适用于测定新扶正除疫颗粒中红景天苷和虎杖苷的含量。

[1] 张雨舟.红景天药理作用研究进展及应用前景分析[J].安徽农业科学，2015，43（25）：77-79、82.

[2] 黄海量.中药虎杖药理作用研究进展[J].西部中医药，2012，25（4）：100-103.

[3] 崔伟亮，李慧芬，刘江亭.大青叶抗病毒抑菌作用研究进展[J].山东中医杂志，2014，33（5）：410-411.

[4] 崔月曦，刘合刚.贯众的研究进展[J].中国现代中药，2014，16（12）：1043-1048.

[5] 王忠波，李丹.RP-HPLC法测定阿哌沙班片的含量及有关物质[J].中国药房，2015，26（6）：828-831.

[6] 韩彩霞，蒋艳红，马海波.心欣颗粒中红景天苷含量测定[J].中国中医药信息杂志，2012，19（6）：51-52.

[7] 李海齐，周凡，胡志林.HPLC法测定复方蔷薇红景天口服液中红景天苷的含量[J].兵团医学，2014，41（3）：4-7.

[8] 刘青，杜守颖，多吉仁青，等.HPLC法同时测定不同产地大花红景天中6种活性成分[J].中草药，2015，46（2）：276-279.

[9] 黄钰芳，李越峰，袁菊丽，等.正交设计-多元回归法优选红景天中红景天苷超声波提取工艺[J].中国药房，2015， 26（22）：3128-3130.

[10] 付锦光.心脑欣片中红景天苷含量测定[J].河北中医，2012，34（1）：105-107.

[11] 戚志华，王庆伟，王四旺，等.HPLC法测定不同生长期女贞子中红景天苷的含量[J].中国药房，2010，21（11）：996-997.

[12] 刘建明，熊立新，余松华.RP-HPLC法测定大鼠血浆中红景天苷的浓度[J].江西中医药，2011，42（2）：64-65.

[13] 车彦忠，王培智，陈洪英，等.HPLC测定护肝宁丸中虎杖苷的含量[J].中医临床研究，2013，5（19）：27-28.

[14] 王亚洲.HPLC法同时测定烫伤合剂中绿原酸、虎杖苷和盐酸小檗碱的含量[J].中国药师，2012，15（7）：993-995.

[15]丁雪鹰，侯晓丽，孙铭学，等.LC-MS/MS测定大鼠血浆中虎杖苷浓度[J].药学实践杂志，2012，30（1）：45-48.

Contents Determination of Salidroside and Polydatin in New Fuzheng Chuyi Granule by RP-HPLC

FU Meili，YAN Mingming，SHAO Shuai，WU Chengyan，LIU Chang，TIAN Shuang，YU Zhongxian，YANG Yang（Chinese Medicine and Bioengineering R&D Center，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of salidroside and polydatin in new Fuzheng chuyi granule.METHODS：RH-HPLC was performed on the column of GRACE Alltima TMC 18 with mobile phase of methanolwater（15∶85，V/V，salidroside）and acetonitrile-water（23∶77，V/V，polydatin）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 275 nm（salidroside）and 306 nm（polydatin），column temperature was 25℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 0.99-10.89 μg for salidroside（r＝0.999 8）and 0.046-1.196 μg for polydatin（r＝0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.31%-99.44%（RSD＝1.20%，n＝6）and 95.96%-99.73%（RSD＝1.42%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reliable，and suitable for the contents determination of salidroside and polydatin in new Fuzheng chuyi granule.

RP-HPLC；New Fuzheng chuyi granule；Salidroside；Polydatin；Content determination

R917

A

1001-0408（2017）06-0809-04

2016-03-01

2016-10-11）

（编辑：刘 柳）

国家科技重大专项课题（No.2012ZX09103201-033）；吉林省科技发展计划项目（No.20150204036YY）

＊硕士研究生。研究方向：中药化学。E-mail：273575508@qq. com

#通信作者：教授。研究方向：中药创新药物。E-mail：yanmm 595@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.24