AuNCs@SiO2金纳米簇复合粒子制备及其对体外口腔癌细胞毒性的研究

张 虎，李英姿，汪德州，宋文植，张天夫

(吉林大学中日联谊医院 口腔科,吉林 长春130033)

AuNCs@SiO2金纳米簇复合粒子制备及其对体外口腔癌细胞毒性的研究

张 虎，李英姿，汪德州，宋文植*，张天夫*

(吉林大学中日联谊医院 口腔科,吉林 长春130033)

目的 制备一种具有荧光性的二氧化硅包覆金纳米簇复合粒子，并研究其体外细胞毒性。方法 以牛血清白蛋白(BSA)介导合成金纳米簇(BSA-AuNCs),改良Stöber法制备二氧化硅包覆的金纳米簇复合粒子AuNCs@SiO2并表征,通过CCK-8细胞相容性实验测试复合纳米粒子对人舌鳞癌细胞CAL27，人口腔表皮样癌细胞KB,小鼠胚胎成纤维细胞3T3的细胞毒作用。结果 AuNCs@SiO2复合金纳米簇粒子在365 nm紫外灯下具有荧光性,透射电镜显示纳米复合粒子为球形、粒度均匀的壳核型粒子,平均粒径52.30 nm;紫外可见光吸收曲线显示，与金纳米簇相比较，氧化硅包覆的金纳米簇复合粒子特征性吸收峰消失,荧光光谱显示最大发射峰轻微蓝移至655 nm处;CCK-8法结果显示，不同浓度AuNCs@SiO2分别作用于细胞24 h，各剂量组与正常对照组相比较，细胞存活率差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论 合成的金纳米簇壳核复合粒子不仅保留了金纳米簇的荧光特性，表层的硅壳还能够提高金纳米簇的荧光稳定性，并且纳米复合粒子对体外口腔癌细胞和小鼠3T3细胞无显著细胞毒性。此种金纳米簇复合粒子有望应用于口腔癌细胞的成像和治疗领域。

金纳米簇；Stöber 法；壳核复合粒子；细胞毒性； CCK-8

(ChinJLabDiagn,2017,21:0471)

近年来，具有高荧光强度特性的荧光纳米颗粒在细胞标记领域得到广泛应用[1]。贵金属纳米簇作为荧光纳米材料之一，由几到几十个金属原子组成，最常见的为金和银纳米簇。金纳米簇具有粒径极小、荧光信号强且稳定、抗光漂白作用强、合成条件温和、绿色无污染、毒性低等特点，使其在生物标记和细胞成像领域有巨大的吸引力[2,3]。以往报道认为金纳米簇具有优异的生物相容性[4,5]，然而近期研究显示金纳米簇能很快进入细胞，并在一定浓度范围内对不同细胞表现出不同程度的毒性[6]。因此本研究中我们采用改良Stöber法将金纳米簇表面包覆一层具有良好表面修饰性的二氧化硅[7]，以期在保持其荧光性的同时改善其生物相容性，并采用CCK8法，研究AuNCs@SiO2纳米复合粒子对人舌鳞癌细胞，人口腔表皮样癌细胞,小鼠胚胎成纤维细胞的细胞毒作用，为该纳米复合载体粒子在口腔医学领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和仪器

实验试剂：四氯金酸(HAuCl4·3H2O，国药集团化学试剂有限公司)，氢氧化钠(Na3C6H5O7·2H2O、 NaOH，美国Sigma公司)，氨水(NH3.H2O，国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(C2H5OH，北京化工厂)，以上试剂均为优级纯；高纯水(Millipore Milli-Q纯水仪新制)，DMEM/1640培养基(GIBCO，美国)，胰蛋白酶(DIFCO，美国 )，胎牛血清(TBD，中国)，正硅酸乙酯TEOS(分析纯，北京化工厂)，使用前减压蒸馏提纯。

实验仪器： SHIMADZUUV-1800紫外分光光度计(日本岛津)， JEM-2010透射电镜(日本电子)，MR3001磁力搅拌器(德国Heidolph),Nano Measurer 1.2测量软件，RF-5301PC 荧光分光光度计(日本岛津)，90Plus Zeta电位及粒度分析仪(美国，NanoBrook)，iMark酶标仪(BIO-RAD，美国)。

细胞株：人舌鳞癌细胞CAL27，人口腔表皮样癌细胞KB,小鼠胚胎成纤维细胞3T3。

1.2 实验方法

1.2.1 BSA-AuNC@ SiO2纳米复合粒子的制备 参照文献以牛血清白蛋白(BSA)介导合成金纳米簇BSA-AuNCs[8]，首先单口烧瓶中加入25 ml BSA (50 mg/ml)溶液37℃水浴5 min，磁力搅拌下加入37℃ 25 ml HAuCl4(10 mM)，封口反应2 min。然后逐滴加入2.5 ml NaOH(1 M)，37℃恒温反应12 h，可见溶液从浅黄变浅棕到深棕色改变。反应产物4℃避光保存。TEM观察粒子形貌，测定其UV-vis 吸收光谱，荧光光谱。

改良Stöber法实现金纳米簇表面二氧化硅层的包覆[9]。200 μl AuNCs 加入 19.2 ml无水乙醇，800 μl氨水混液中，超声处理5 min，向体系中加入200 μl TEOS，磁力搅拌反应1 h，再加入200 μl TEOS，磁力搅拌反应24 h。9 000 rpm离心醇洗两次，水洗两次，得到氧化硅包覆的金纳米簇复合粒子。所得样品置于365 nm紫外灯下照射，TEM观察粒子形貌，计算粒子粒径，测定其UV-vis 吸收光谱，荧光光谱，粒子电位。

1.2.2 CCK-8法检测BSA-AuNC@ SiO2纳米复合材料体外细胞毒 取对数生长期的Cal27、3T3、KB细胞，胰蛋白酶消化，将细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度分别至(0.8×105)/(0.8×105/mL)/(1.0×105/mL) 个/mL接种于 96 孔培养板中，每孔100 μl，置于37℃，5% CO2细胞培养箱内培养24 h。PBS液洗细胞 1 次后，分别加入不含血清DMEM/1640培养液配制的纳米材料溶液，使其终浓度分别为6.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100 μg/mL和200.00 μg/mL，正常对照组加无血清DMEM/1640培养液，每组 3 复孔。继续培养 24 h 后，每孔加入 CCK-8 试剂 10 μl，继续孵育 2 h，采用酶标仪检测各孔在 450 nm 波长处的吸光度值，按以下公式计算计算各组细胞存活率。

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100%。

注:A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度;A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度;A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

2 结果

2.1 AuNCs和AuNCs@SiO2纳米材料紫外-可见吸收光谱

AuNCs和AuNCs@SiO2紫外-可见吸收光谱见图1，显示了BSA-AuNCs以及AuNCs@SiO2的紫外可见光吸收光谱。金纳米簇的吸收峰在290 nm左右，主要受其表面BSA对紫外光吸收的影响。包硅后的复合纳米粒子没有特征性吸收峰。

图1 AuNCs和AuNCs@SiO2紫外吸收光谱

2.2 AuNCs@SiO2纳米复合粒子电镜观察

由透射电镜照片(图2)显示AuNCs@SiO2纳米复合粒子平均粒径52.30 nm，为尺寸均一、球形的壳核型粒子，但无论在高浓度还是低浓度下，粒子均不是单分散性的，Zeta电位及粒度分析仪检测可知其AuNCs@SiO2纳米复合粒子表面带有-34 mV电位，使其能够抵抗聚集和沉淀，故本实验制备的AuNCs@SiO2纳米复合粒子在4℃冰箱可数星期保持稳定呈溶胶态。良好的稳定性是这种复合粒子进一步得到应用的前提。

图2 壳核型的金纳米团簇AuNCs@SiO2高浓度以及稀释后溶液的透射电镜图×100000

2.3 AuNCs@SiO2纳米复合粒子荧光性检测

图3为AuNCs和AuNCs@SiO2荧光光谱。荧光光谱结果显示BSA-AuNCs 激发峰540 nm，发射峰660 nm,在660 nm光激发下，金纳米簇有明显的荧光发射峰，而实验中单纯的BSA溶液以及氯金酸溶液均没有荧光发射，表明已成功地合成了金纳米簇。当包覆SiO2层后，AuNCs@SiO2粒子最大发射峰发生轻微蓝移至655 nm处，且强度较AuNCs有所降低。

图4为金纳米簇和AuNCs@SiO2金纳米簇复合粒子在日光下及365 nm紫外灯光下照片，可以看出在365 nm紫外光照射下两种粒子均发出明显荧光，由于SiO2层的影响AuNCs@ SiO2荧光强度较AuNCs稍有减弱，与荧光光谱强度结果相对应。

图3 AuNCs和AuNCs@SiO2荧光光谱图(左侧为最大吸收激发波长，右侧为最大发射波长)

图4 AuNCs和AuNCs@SiO2在日光灯和紫外灯照射下的照片，左侧为AuNCs，右侧为AuNCs@SiO2

2.4 AuNCs@SiO2纳米复合粒子细胞毒性研究

我们采用CCK-8法检测金纳米簇复合粒子对人舌鳞癌细胞Cal27、小鼠成纤维细胞3T3、头颈部鳞癌细胞KB细胞存活率的影响。结果表明，不同浓度AuNCs@ SiO2分别作用于细胞24 h后，随着作用剂量的增加，细胞存活率改变不大，各剂量组与正常对照组相比较，差异不具有统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 不同浓度AuNCs@SiO2复合粒子作用下细胞存活率 (n=3,x—±s，%)

3 讨论

荧光标记技术是细胞生物学领域重要研究手段之一，结合荧光显微成像技术可以实现细胞及亚细胞生命过程可视化的监测，检测的灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度和稳定性。袁媛等发现BSA介导合成的金纳米簇可成功进入宫颈癌细胞，达到较好的活细胞荧光标记效果，且在经过细胞固定化处理后仍保持其标记形态[10]。Chen等利用金纳米簇修饰包被染料的硅壳形成纳米复合物，用于检测活细胞内高活性氧，发现其具有高选择性，高对比度，以及较高的胞内运输效率[11]。由于金纳米簇粒径极小，较难进行分离和纯化[12]，我们采用改良Stöber法在其表面包覆一层SiO2，制备出的AuNCs@ SiO2纳米复合粒子可以离心纯化；金属纳米粒子的光学特性是由电子的表面振动产生的，被称为表面等离子体共振。不同结构的金纳米簇具有其特征性的吸收光谱，并且可以从它的特征吸收曲线进行区分[13]。包覆SiO2后粒径变大，复合粒子的特征性吸收峰消失，可能是由表面SiO2层影响了BSA对紫外光的吸收导致的，此结果与以往的研究结果一致[9]。

此种二氧化硅包覆的壳核结构复合粒子保留了原金纳米簇的荧光特性，但发射峰轻微蓝移，荧光强度略有降低，可能是因为金纳米簇受表面硅层的影响性质发生了一些改变，这种变化与以往文献[14]报道中关于纳米荧光染料在包硅后荧光光谱变化结果相类似。

由于氧化硅具有良好的表面可修饰性，故此种纳米复合粒子可进一步在硅壳表层修饰药物分子或其它功能性粒子，形成多功能纳米复合粒子系统[15]，更重要的是，表面致密的硅壳能够提高荧光性金纳米簇的光稳定性及化学稳定性[16]， 为应用于生物医学领域奠定良好基础。

本研究所采用的CCK-8比色法是一种能够快速进行药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验的比色方法，具有使用方便，灵敏度高，数据可靠，重现性好，对细胞毒性低等优点，因此目前在国际上广泛应用于免疫学、肿瘤学及医用材料的生物相容性研究。通过CCK-8实验观察可以证实此种复合纳米粒子对口腔癌细胞Cal27，KB以及小鼠3T3细胞均没有明显毒性。虽然此种纳米复合粒子的合成和生物医学应用尚在初期研究阶段[17]，金纳米簇复合粒子的表面修饰、进入细胞的方式和代谢方式仍需进一步研究，但此种AuNCs@ SiO2纳米复合粒子在包括口腔癌在内的恶性肿瘤细胞成像和治疗领域已展现出有价值的应用前景.

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Preparation of silica-coated gold nanoclusters and its evaluation of oral cytotoxicity in vitro

ZHAGNHu,LIYing-zi,WANGDe-zhou,etal.

(Dept.ofStomatology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To prepare fluorescent silica-coated gold nanoclusters nanocomposite particles and evaluate the cytotoxicity in vitro.Methods Silica coated gold nanoclusters (AuNCs@SiO2)was prepared by modified Stober method and characterized by the transmission electron microscope,UV-VIS spectrophotometer,fluorescence spectrophotometer etc.The cytotoxicity on CAL27,KB and 3T3 cells in vitro was assessed by CCK-8 method.Results The AuNCs@SiO2nanocomposite particles emit red fluorescence under 365 nm UV light;TEM showed the mean effective diameter of the core-shell nanoparticles was approximately 52.30 nm with uniform,spherical shape.The absorption peak of the AuNCs@SiO2disappeared in UV-vis spectra;The fluorescence spectrum showed that the emission peak exhibited a slight blue shift to 655 nm;CCK-8 assay showed that after cultured with different concentration of AuNCs@SiO2for 24 hours,the survival rates of three kind of cells had no statistical difference compared with the control group.Conclusion The silica layer played protective role to the photostability of the fluorescent AuNCs，and the nanocomposite particles had no obvious cytotoxicity on oral cancer cells CAL27,KB and mouse embryo fiberblasts3T3.AuNCs@SiO2nanomaterial is promising in malignant neoplasm cell image including oral cancer.

AuNCs/modified Stober method/core-shell nanocomposite particles/oral cancer/CCK-8

国家自然科学基金项目(81372900);吉林省科技厅项目(20110708，20120713)

1007-4287(2017)03-0471-04

R780.1

A

2016-11-02)

*通讯作者