海洋酸化对青蛤免疫指标的影响

梁 健, 高 山, 李永仁, 殷 潇, 刘金桥, 郭永军, 闫喜武

(1. 天津农学院 水产学院, 天津市水产生态及养殖重点实验室, 天津 300384; 2. 大连海洋大学, 辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心, 辽宁 大连 116023)

海洋吸收空气中的二氧化碳形成碳酸, 增加海水的酸度, 这种现象称为海洋酸化[1]。这是由Caldeira等[2]于2003年首次提出, 得到了科学界的广泛关注, 成为当今国际海洋科学研究前沿领域的重要方向。同工业革命前的水平相比, 目前海洋的 pH降低0.1个单位, 据预测到 21世纪末期将持续降低0.3至0.5个单位, 到2300年大气中增加的CO2浓度将会引起 pH 降低0.7个单位[1]。海洋酸化对海洋生态系统的平衡产生重大的影响, 可能导致物种组成(珊瑚、贝类、棘皮动物、甲壳动物和鱼类等)发生变化。贝类作为主要的钙化生物, 是近年来研究海洋酸化对生态系统的影响的主要对象。

贝类相对低等, 不能完成特异性免疫, 只能依靠血细胞完成非特异性免疫。贝类的非特异性免疫较为完善, 包括细胞免疫和体液免疫。细胞免疫的主要承担者是血淋巴细胞, 参与了机体损伤的修复、贝壳的重建、吞噬异物颗粒和消除有毒物质等过程[3]。体液免疫的手段主要包括由血淋巴细胞分泌的各种水解酶类、非特异的抗菌肤类、高等动物细胞因子类似物、调理素和凝集素等[4]。

青蛤(Cyclina sinensis), 别称赤嘴仔, 属软体动物门、双壳纲、帘蛤目, 是我国沿海滩涂重要的经济贝类之一。其味道鲜美, 营养价值高、生长快速、滤水效果好、抗逆性强、耐盐范围广(8~37, 最适 15~25)、耐碱能力强(0~40 mmol/L)等特点, 深得沿海贝类养殖者的青睐, 形成较大规模的养殖产业。本实验以通过设定两组低pH条件(pH 7.7和pH 7.4)的酸化海水组, 并以正常海水pH做为对照, 探究酸化对青蛤免疫指标的影响, 从免疫学角度评估酸化对青蛤所造成的影响程度, 对预测青蛤养殖业和物种本身的未来发展趋势提供一定的依据。

1　材料与方法

1.1　材料

青蛤取自天津独流减河河口, 个体健康、大小相似, 平均壳长34.13 mm±0.61 mm (n=400)。在室内暂养 7 d后进行实验, 养殖用水为砂滤海水, 盐度 25,温度25~28, ℃暂养期间连续充氧, 每天全量换水1次, 投喂小球藻。暂养后选择闭壳能力强、反应迅速的个体作为试验用贝。

1.2　酸化条件的建立

通过像水体中通入 CO2的方法来模拟海洋酸化的过程。使用气体质量流量控制器和积算仪(七星华创电子股份有限公司)精确控制 CO2通入量, 维持养殖水槽(400 L)中海水pH值在所设定的范围内。实验所用水槽均配有独立的循环过滤系统以达到去除粪便、降低氨氮和净化水质, 并加有充气设备。CO2通过水族缸使用的气体细化器充入海水中, 溶解充分提高酸化效率。

1.3　实验方法

建立酸化实验组以模拟 2100年和 2300年海洋所达到的海水pH (分别为7.7、7.4)[1], 并以正常海水作为实验对照组(pH 8.1)。各实验组放置青蛤120枚,每天3次测量各实验组的 pH值、溶解氧 DO、盐度、温度, 并根据实际测得数值调整 CO2通入量,保证酸化实验组的pH正负偏差不超过0.1。试验期间投喂小球藻、等鞭金藻、新月菱形藻, 投喂后再次调整 pH。每两天换水四分之一, 及时挑出死亡个体并记录。

1.4　血淋巴液的制备

在酸化的第0、7、14、21、28 天, 从各实验组随机选取15枚青蛤, 用1 mL针管从闭壳肌处抽取血淋巴液, 将 5个青蛤的血淋巴液混合作为一个测定样品放入 2.5 mL离心管中, 置于冰上保存, 待后面指标的测定。

1.5　指标测定方法

血细胞总数的测定采用血细胞计数板进行测定。稀释液为贝类生理盐水, 配方: 0.02 mol/L HEPES,0.4 mol/L NaCl, 0.1 mol/L MgSO4, 0.01 mol/L KCl,0.01 mol/L CaCl2, 调节pH为7.4。

酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氢酶(CAT)、戊二醛(MDA)、溶菌酶活性均采用南京建成生产的检测试剂盒, 参照随之附送的各使用说明书进行操作。

1.6　数据处理与分析

数据使用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。结果用平均数±标准差表示, 采用单因子方差分析法(one-way ANOVA)进行方差分析, 运用 Duncan test对数据进行显著性检验, 显著性水平为P < 0.05。

2　结果

2.1　海水温度、盐度、溶解氧和pH

为尽量减少其他环境因子对结果的影响, 本试验维持海水温度和盐度在较小的变化范围内。图 1表明, 在酸化期间海水温度整体范围保持在 26~31℃, 盐度保持在25。

图1　海水温度和盐度变化Fig. 1 Changes in seawater temperature and salinity

图 2所示整个试验期间溶解氧含量均保持在较高水平, 三实验组的溶解氧含量范围均在(7.4±0.3) mg/L~(8.5±0.5)mg/L, 能够保证青蛤正常生理活动的耗氧需求。

图2 实验期间各组海水溶氧Fig. 2 Variation of dissolved oxygen in each group

图3所示对照组在第0 ~14 d时pH波动较大, 随后逐渐趋于稳定。两实验组维持在实验设定的固定数值, pH变化范围控制在±0.5。

实验期间, 只有在第 7 天对照组(pH8.1)和 21 d酸化组(pH7.4)组各死亡一枚, 其余时间内并未死亡。

2.2　酸化对血细胞总数影响

图4所示, pH 8.1组和pH 7.7组的血细胞总数整体趋势较稳定。pH 7.4组的变化较大, 总体呈降低的趋势, 0~14 d差异不显著(P>0.05), 但与21 d和28 d差异均显著(P<0.05)。在14 d和28 d时三实验组彼此差异显著(P<0.05)。

图3　海水pH变化Fig. 3 Changes in seawater pH

图4　酸化对血细胞总数的影响Fig. 4 Effects of acidification on the total number of blood cells

2.3　酸化对溶菌酶活性影响

图 5所示溶菌酶活性, pH8.1组整体趋于稳定;而pH7.7呈逐渐降低趋势; pH7.4组呈先升高后降低,在第14 天时到最大值。各实验组在各时间点差异均不显著(P>0.05), 相同时间点三实验组之间的差异性也不显著(P>0.05)。

2.4　酸化对ACP活性影响

图6所示ACP活性, pH8.1组整体保持基本不变;pH7.7组和pH7.4组呈先降低后增长再降低的趋势。但各实验组在各时间点差异均不显著(P>0.05), 相同时间点三实验组之间的差异性也不显著(P>0.05)。

图5　酸化对溶菌酶活性的影响Fig. 5 Effects of acidification on the lysozyme activity

图6 酸化对青蛤ACP活性的影响Fig. 6 Effects of acidification on the ACP activity

2.5　酸化对ALP活性影响

图7所示, 三实验组的ALP活性随时间增长均呈递增的趋势, 相同时间点上三实验组之间 ALP活性的差异性不显著(P>0.05), 且 pH 7.7实验组 ALP活性最低。

图7 酸化对青蛤ALP活性的影响Fig. 7 Effects of acidification on the ALP activity

2.6　酸化对SOD活性影响

图8所示, 三实验组 SOD活性在第 21 天均有显著增加的趋势(P<0.05), 其余时间内相对平稳。在14 d酸化组SOD要高于对照组。到21~28 d时, 酸化组降低, 对照组高于酸化组。在第 14 天和第 21天三实验组彼此差异显著(P<0.05), 其他时间差异均不显著(P>0.05)。

图8 酸化对青蛤SOD活性的影响Fig. 8 Effects of acidification on the SOD activity

2.7　酸化对CAT活性影响

图9所示, pH7.7组CAT活性在第28 天有较为突出的升高(P<0.05), 其余时间基本稳定不变。pH7.4组则表现为不断增长的趋势。21 d达到最大值, 28 d时略下降。酸化胁迫下各时间点上三实验组彼此差异显著(P<0.05)。

图9 酸化对青蛤CAT活性的影响Fig. 9 Effects of acidification on the CAT activity

2.8　酸化对MDA含量影响

图10所示, pH8.1和pH7.7组MDA含量均呈先增加后降低再增加的趋势。pH7.4组为先降低再升高最后降低, 第 21 天时达到最大值。总体上看, 试验期间两个酸化实验组的MDA含量要低于对照组。

3　讨论

图10　酸化对青蛤MDA含量的影响Fig. 10 Effects of acidification on the MAD count

作为细胞免疫承担者的血细胞, 其数量作为重要的生理指标, 受种类、年龄、生态状态和环境胁迫的影响较大[5]。本次试验前期血细胞总数出现短暂的升高, 原因可能由于青蛤自身免疫的应激性。一些学者认为短时间污染物的刺激可以导致血细胞数量增加[6], 造成的原因可能是刺激物让血细胞进入循环系统或者是细胞膜稳定性降低的补偿的结果[7]。但当机体长时间受酸化胁迫后, 超出自身耐受范围, 血细胞总数将受到影响开始下降。丁鉴锋等[8]指出高浓度 Cu2+等重金属长期胁迫下, 菲律宾蛤仔血细胞总数明显降低, 与本次试验结果一致。Cheng等[9]发现pH变化(7.6~4.8和9.3)7 d时罗氏沼虾血细胞数量明显降低。Matozzo等[10]也研究了海洋酸化和暖化对贝类免疫力的影响, 结果表明血细胞并非一直呈线性变动, 但也受到酸化显著影响。所得结论不仅和本试验结果一致, 还提出了另外一条结论: 即在酸化条件相同情况下, 不同的种类, 酸化效果各异。本试验结果说明青蛤血细胞对外界 pH存在一定耐受范围,当受到的pH胁迫超出机体的适应范围时, 其数量会减少, 并显示出血细胞总数随酸化程度及其相关(P<0.05)。

溶菌酶、ALP和 ACP均来自血细胞溶酶体中,是研究血细胞体液免疫的重要指标。低浓度氨氮胁迫对凡纳宾对虾(Litopenaeus vannamei)时, 溶菌酶活性升高, 随着浓度的升高, 溶菌酶反而下降[11]。本试验也有相似结论, 0~14 d时, 随着酸化时间段的增长, 溶菌酶逐渐呈现上升趋势, 14 d时酸化组均大于对照组, 这可能是刺激源改变了溶酶体膜的通透性,溶菌酶外渗, 参与对刺激源的杀伤和清除[8]。此后14~28 d时, 溶菌酶又呈下降趋势, 28 d达到最小值。这可能是机体由于应激反应使其活性升高, 超过自身阀值, 活性受到抑制。对于同样是pH的改变作为外源刺激, 李晓梅等[12]在研究海洋酸化背景下铅胁迫近江牡蛎(Crassostrea rivularis Gould)对溶菌酶活性的试验中, 所得结论也与本试验相同。

酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)是重要的体液免疫水解酶, ACP和ALP具有相同的作用效果:辅助吞噬作用消除异物。不同作用效果在于 ACP有催化效果, 而ALP更多在于起到调理、调节的作用[4]。梁健等[13]指出 Cu2+半致死浓度胁迫下青蛤血淋巴液中 ACP 活性呈现出先升高后抑制的趋势。饶玉才[14]发现背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的ACP活性随pH下降先上升后下降, 在pH高于对照条件下, ACP活性在pH7.5略下降, 然后随pH增高分别急剧上升和下降。本研究中机体自身受到酸化胁迫后 ACP活性逐渐升高最后在28 d时酸化组(pH7.7和pH7.4)出现明显的下降。活性升高可能是由于“应激”导致; 胁迫后期ACP活性的降低可能通过以下两条途径所导致: 一是由于环境刺激造成的贝类血细胞溶解, 导致含有ACP的溶酶体失活; 二是可能改变了血细胞内溶酶体的膜通透性, 导致ACP渗漏。ALP活性表现与 ACP存在差异, 于第28天时, ALP处于上升趋势, 且酸化组(pH7.4)略大于对照组(pH8.1), 推测是因为酸化组pH为7.4只能引起自身产生相应的应激效果, 并未达到抑制ALP的最小pH。任加云等[15]在指出在0.3和0.5 mg/L石油烃的胁迫下, 栉孔扇贝的ALP活性呈上升趋势, 而1 mg/L时ALP活性明显下降, 这一现象充分证明了本文的推测。彭怀明等[16]也有相同结论, 但其认为原因可能是血细胞的破坏造成溶酶体的释放。

SOD、CAT和 MDA是免疫能力检测的重要指标。当刺激源侵害机体时, 机体便会产生氧化应激反应, 从而产生一系列的脂质过氧化产物, 如丙二醛(MDA), 它可以影响细胞膜流动性和通透性, 导致功能的改变[17]。于庆云等[18]测定菲律宾蛤仔消化腺和鳃SOD活性在酸化条件下随着时间的增长, 呈现先增加后降低的趋势。有学者指出草鱼SOD活性随着 pH不断地下降和酸化时间的增长呈先上升后下降的趋势[19]。陈琳琳等[20]提出重金属能够在短期内增加紫贻贝抗氧化酶的活性, 但随着胁迫时间的延长, 便会抑制相关抗氧化酶的活性。本试验酸化试验初期, 7~14 d时, SOD活性出现短暂的升高, pH的降低使体内迅速产生活性氧, 抗氧化能力被激活, SOD活性上升, 以降低其细胞膜的脂质氧化程度; 随着酸化胁迫时间的增长, 18~21 d, 低pH诱导产生的活性氧超出调控阈值, 便抑制了SOD活性, 使SOD活性低于对照组。

CAT能够分解清除由 SOD歧化作用产生的H2O2从而保护细胞不受损伤, CAT和SOD在抗氧化,清除刺激胁迫产生的活性氧自由基时, 往往是共同协作。本试验中试验组随酸化时间的增长呈上升的趋势, 究其原因可能是: 1)酸化组所设 pH梯度不能抑制CAT活性, 使CAT活性仍然处在“诱导”阶段。2)酸化的时间较短, 不能够导致对CAT活性的抑制。另外结果中对照组CAT活性在酸化胁迫中并不稳定,出现有规律性的波动, 这可能是来自于温度的影响,本次试验是在夏天进行, 水温较高, 有学者认为, 在夏天贝类CAT会普遍较高, 呈季节性变化[21]。

本试验中实验组 MDA含量随酸化时间的延长呈先升高后降低的趋势, 但试验组MDA含量始终小于对照组且差异明显, 说明生物体内活性氧的累积程度和细胞的损伤程度均处于较低水平, 非酶促反应起主要作用。机体自身的抗氧化防御系统有两类,一类是酶促防御系统, 包括 SOD、CAT等; 另一类是非酶促反应, 包括还原型谷胱甘肽(GSH)、维生素E等[22]。当酶促防御系统SOD等受到酸化的胁迫, 导致活性降低, 机体可能提高非酶促反应, 来弥补酶促反应的不足, 导致MDA含量较低。

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