草莓无病毒原原种苗生产技术研究*

钱长根 周素梅 朱造杰 屠娟丽 秦 伟 严成其

（1.嘉兴职业技术学院，浙江嘉兴314036；2.嘉兴碧云花园有限公司，浙江嘉善314113；3.浙江省嘉善县干窑镇农技水利服务中心，浙江嘉善314107；4.嘉兴中瑞生物科技有限公司，浙江嘉兴314002；5.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州310021）

草莓通常用匍匐茎繁殖育苗，生长期间易受病毒病、炭疽病、灰霉病、疫病等多种病害危害，其中以病毒病种类最多、防治最为困难。据报道，草莓病毒病和类病毒病的种类繁多，约有28种左右，主要有草莓轻型黄边病毒（SMYEV）、草莓镶脉病毒（SVBV）、草莓皱缩病毒（SCrV）和草莓斑驳病毒（SMoV）等。受病毒侵染的草莓苗，初期症状并不明显，病株仅轻微矮化，后期草莓植株长势逐渐变弱[1]。当田间有大量植株表现出受病毒危害症状时，病毒已经大量存在于病株体内，很难再有效地控制其传播和蔓延，草莓产量和果实质量严重下降。因此，防治草莓病毒病最有效的方法是持续培育新品种取代原有主栽品种，以实现品种的更新换代，或通过无病毒草莓原原种苗的生产，实现品种的提纯复壮，避免病毒危害。由于我国目前草莓主栽品种大多数从国外引进，用现有主栽品种培育无病毒草莓苗，实现品种提纯复壮是草莓预防病毒病一条现实而有效的途径。

1 草莓无病毒苗培养的理论依据

1.1 病毒在植物体内分布不均匀

研究表明，病毒在草莓等植物体内的分布是不均匀的，顶端分生组织一般无病毒或只带有浓度很低的极少量病毒，病毒数量、浓度随着与茎尖、根尖距离加大而增加。在草莓等植物体内，病毒一般通过维管束组织移动、蔓延，而顶端分生组织中不存在维管束组织，病毒只能通过胞间连丝在细胞间缓慢移动，难以入侵生长状态高度活跃的茎尖或根尖组织[2～3]。而且，顶端分生组织的细胞分裂活动极其旺盛，其内源激素水平和代谢活性均非常高，病毒难以复制和增殖，从而使草莓根尖或茎尖顶端分生组织的病毒带毒率极低，因此利用根尖或茎尖分生组织培育无病毒苗的成功率非常高。

1.2 植物细胞全能性学说

根据植物细胞的全能性学说，植物体任何一个细胞都带有能发育成完整植株的全套遗传信息，在离体培养条件下，这些遗传信息能完全表达，形成与母体相同的完整植株。草莓茎尖、根尖分生组织细胞同样带有草莓植株的全套遗传信息，在离体培养条件下，同样能培养出具备草莓主栽品种优良性状的优质无病毒草莓苗。

2 草莓无病毒苗组培快繁技术

2.1 无菌系的建立

（1）外植体选取与采集：在苗期精心选取健壮无病的草莓苗进行标记，待其匍匐茎长出顶芽时，选取、采集标记过的草莓苗中生长良好的匍匐茎顶芽带回实验室，作为草莓离体培养的外植体。（2）外植体处理：选择生长充实而小叶尚未展开的匍匐茎顶芽，切下2～3cm长，用自来水冲洗2～3h后，在超净台上进行消毒灭菌处理。消毒处理时，先用小镊子摘除匍匐茎外围较大的叶片，而后用70%～75%酒精消毒20～30s，再置于0.1%升汞溶液中消毒6～8min或放在10%漂白粉上清液中浸泡10～15min，最后用无菌水冲洗6～8次。灭菌时摇动灭菌容器，使草莓组培外植体与消毒灭菌药剂充分接触。在灭菌剂里滴入数滴0.1%Tween20或Tween80湿润剂，灭菌效果更好[4]。（3）诱导分化培养：切取芽下茎段，接种于MS+6-BA 0.5～3mg/L的诱导分化培养基上。接种前培养基中加入白糖3%、琼脂粉0.5%～0.6%，pH值调至5.8。每瓶内接种外植体1～3个，接种后移至培养室内培养3～4周。培养室要求光照强度为1500～2500Lx，光照时间12～15h/d，室内温度22±4℃。

2.2 脱毒培养

（1）茎尖培养：一般在每年的5～6月份，取经过诱导分化培养出的草莓无菌小苗置于实体显微镜下，用小镊子由外及里层层剥去茎尖幼叶和鳞片，找到带1～2个叶原基的生长点，用接种针挑出0.3～0.5mm茎尖生长点，将生长点接入MS+6-BA 0.5～3mg/L诱导培养基中，每瓶接种1～2个。培养室光照强度为1500～2500Lx，光照时间12～15h/d，温度22±4℃，培养时间3～4周[5]。（2）防止褐化：草莓茎尖培养初期易出现褐化现象。引起褐化的原因很多，与品种、取材部位和时间、外植体大小、受伤害程度以及培养条件等有关。当培养室温度过高或光照过强时，多酚氧化酶活性提高，从而加速了外植体褐化。如果褐化现象严重，应及时更换培养基，进行转接继代培养，并适当降低培养室温度和光照强度，必要时，在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂等。一般情况下，培养20～25d后进行培养基更换与转接，以减轻或避免草莓外植体褐化[6～7]。

2.3 增殖培养

一般情况下，每年6～8月是草莓无病毒组培苗快繁中进行增殖培养的最佳时间。此时宜将分化3mm以上、带2片小叶的草莓苗新芽切离母体，并及时转入MS+6-BA 0.6～1.0mg/L快繁增殖培养基中进行快繁增殖培养。培养室光照强度为1500～2500Lx，光照时间12～15h/d，温度22±4℃。一般增殖培养周期为4～5周，增殖培养可连续转接培养4～8代。

2.4 生根培养

（1）瓶内生根：将通过增殖培养后形成的草莓组培增殖幼苗带茎叶切离母株，作为新的培养材料转接入1/2 MS+NAA 0.3～0.8mg/L生根培养基上进行诱导生根培养。培养条件为光照强度1500～2500Lx、光照时间12～15h/d、温度22±4℃，培养周期为3～4周。（2）瓶外生根：草莓组培苗还可转至无菌滤纸上进行保湿诱导生根培养，实现草莓组培苗瓶外生根。草莓组培苗瓶外生根培养前，可用组培幼苗蘸取植物生长调节物质进行生根诱导，适宜浓度为IBA 800mg/L。在进行滤纸培养诱导生根时，要调节好培养室内温度、湿度和光照强度等条件，适宜温度为20～30℃、湿度85%～95%、光照强度4000～10000Lx。

3 草莓无病毒原原种苗栽植和培育技术

3.1 组培瓶苗穴盘栽植和培育

（1）转入温室，栽前炼苗。草莓组培苗经3～4周的生根培养，幼苗生出长度超过1cm的新根3条以上时，即可转入温室中进行炼苗[8]。一般瓶内炼苗时间控制在7～10d，其中打开瓶盖炼苗时间为3～5d，尽量创造条件使幼苗逐渐适应瓶外温室内的温湿度及光照条件。炼苗过程中应及时补充水分，防止幼苗缺水萎蔫。（2）基质装盘，清洗幼苗。移植前须准备好穴盘和洁净基质，常用基质有草炭、椰糠、珍珠岩、蛭石等，基质用1000mg/L多菌灵药液消毒灭菌后装入穴盘。向组培瓶内倒入适量清水并摇动瓶子，以松动瓶内培养基，而后取出组培苗置于清水中，轻轻地清洗掉粘附在幼苗根系上的培养基，然后将幼苗移植到装有洁净基质的穴盘中。（3）及时移植，精心培育。先用木棒或竹签在穴盘基质中间挖一栽植穴，轻轻地将草莓组培幼苗的根部放入栽植穴中，使幼苗根系保持舒展状态，而后覆盖基质并壅实。移植后，将穴盘放入温室或连栋大棚中的移动苗床上，上面搭小拱棚、盖保湿膜，并加盖1层遮阳网，拱棚内空气相对湿度保持85%～95%。保温保湿培养1周后，逐渐揭开小拱棚上的遮阳网和薄膜，先两头通风，后两侧通风，最后全部揭除遮阳网和保湿膜，使幼苗渐渐适应温室或大棚内的生长环境。及时控温调湿，防止幼苗失水萎蔫。

3.2 草莓穴盘苗床栽植和培育

3月上中旬，当穴盘苗培养3～4周，根系布满穴盘并长出穴盘底孔后，即移栽到专用苗床上进行床栽培育。

3.2.1 翻耕筑畦，及时移栽

选用非重茬地种植，栽前1～2周翻耕整地，整平、整实、整细、整匀土壤，开沟筑畦宽1.8～2.0m。结合翻耕整地667m2施有机肥1000kg、过磷酸钙25kg，使肥土均匀混合。3月上中旬定植无病毒原原种苗，每畦栽植1行，株距60～100cm。浅栽，栽后及时浇透定根水，并加强水分管理，确保幼苗成活[9]。

3.2.2 加强管理，培育壮苗

草莓无病毒原原种苗的壮苗标准为具有4张以上正常展开叶、根系发达、新根多、根茎粗1cm左右、单株重15g以上、无病虫害。为育足、育好壮苗，须加强草莓无病毒原原种苗育苗期的田间管理，及时做好雨季排水、干旱浇水等工作。适时追肥，随时摘除花蕾、老叶，及时整理藤蔓，使草莓原原种苗匍匐茎在畦面分布均匀，并做好培土压蔓工作。同时，应及时做好田间除草和草莓病虫害防治等工作，确保培育足够的壮苗。

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[5] 李志强，王晶，等.草莓热处理结合茎尖脱毒技术研究[J].北方园艺，2012（05）：125～127.

[6] 王常芸，李晓亮，等.草莓脱毒技术与开发应用[J].山东农业科学，2007（4）：118～122.

[7] 王会.红实美草莓脱毒技术研究[J].长江蔬菜，2009（8）：14～17.

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[9] 夏波，魏秀水，等.草莓脱毒种苗快繁节本关键技术研究[J].长江蔬菜，2006（3）：44～45.