猪伪狂犬病基因缺失弱毒疫苗的研发及应用进展

姚海飞张万红严曙光

（1.淮安市洪泽区动物疫病预防控制中心，江苏洪泽 223100；

2.淮安市洪泽区东双沟镇畜牧兽医站，江苏洪泽 223100）

猪伪狂犬病基因缺失弱毒疫苗的研发及应用进展

姚海飞1张万红1严曙光2

（1.淮安市洪泽区动物疫病预防控制中心，江苏洪泽 223100；

2.淮安市洪泽区东双沟镇畜牧兽医站，江苏洪泽 223100）

猪伪狂犬病（Pseudorabies）是一种以发热、脑脊髓炎、繁殖障碍为主要症状的急性、热性传染病。病原为伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）。近年来该病给我国养猪业造成了重大的经济损失。目前该病尚无特效治疗药物，主要采用疫苗接种作为重点防控手段。因此，本文重点综述了近年来临床使用较广泛的猪伪狂犬基因缺失弱毒疫苗的研发及应用情况。

猪伪狂犬病；弱毒疫苗；基因缺失

猪伪狂犬病是由疱疹病毒科伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种以发热、脑脊髓炎、繁殖障碍为主要症状的急性、热性传染病[1]。我国将本病列为二类动物疫病。猪是伪狂犬病毒的天然宿主、贮存者和传播者。该病毒可感染各个年龄段的猪，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、哺乳仔猪高死亡率及种猪不育等，而且该病还可影响免疫系统，继而导致与其他疾病（如蓝耳病等）发生混合感染的概率大大提高[2]。目前，猪伪狂犬病在我国广泛流行，严重威胁着猪群的健康，并造成了严重经济损失。

该病最为有效的策略防控是疫苗免疫。目前我国使用最广泛的是通过基因工程改造的PRV活病毒疫苗，本文将对该类疫苗目前的研究进展进行论述。

1 PRV基因缺失疫苗研究进展

随着基因工程技术的快速发展，以及对PRV各病毒蛋白功能的不断深入研究，一类新型的PRV减毒活疫苗逐渐发展起来。该类疫苗主要通过分子生物学的手段，对PRV基因组中毒力基因若干碱基进行删除，已达到彻底失活该基因的目的，但仍能保留该毒株较强的免疫原性。

1.1 单基因缺失PRV疫苗

1.1.1 TK单基因缺失的PRV疫苗

该类疫苗是1986年美国批准上市的的第一批PRV基因工程疫苗。该疫苗以BUK毒株为母本，缺失TK序列上一段148bp长度的序列构建而成。该毒株非常稳定，在传代多次后仍保持TK缺失状态。该类疫苗代表性毒株包括BUK-dl3、NIA-3、ADV-783、Begonia等毒株。动物试验表明，该疫苗不仅安全性好，而且攻毒保护率较高[3]。我国学者也分别在本土PRV流行毒株的基础上成功缺失了TK基因并对缺失毒株进行了一系列生物学特性等研究并取得较好进展[4-6]。总体而言，TK单缺失后PRV毒力可以下降到尚可接受的水平，故当前的PRV基因工程疫苗均在现有TK基因单缺失的基础上进行进一步研发。

1.1.2 gD单基因缺失PRV疫苗

gD基因有利于增强子代病毒感染性，进而增强感染动物向其他动物传播的能力。因此缺失该基因制备的PRV基因工程疫苗对动物的毒力较低，且可诱导免疫猪产生了较好保护力。

1.2 双基因缺失PRV疫苗

尽管TK基因缺失可以显著降低毒株毒力，但无法用血清学的方法区分野毒感染和疫苗感染，因此在TK缺失的基础上，在编码非必需糖蛋白的基因内引入一个新的缺失，或插入一个报告基因，这样得到的突变株不能产生缺失糖蛋白，免疫动物后不能产生相应抗体，因此可以通过血清学方法区分免疫接种和野毒感染猪，多基因的缺失也有助于进一步降低毒株的毒力。

1.2.1 TK-/gE-双缺失疫苗

gE基因缺失有助于对疫苗接种和野毒感染猪只做鉴别诊断，因此在TK缺失的基础上进一步缺失gE基因研制PRV基因工程疫苗，在世界范围内得到了广泛的认可和应用。VanOirschot等于1990年以NIA-4为母本病毒，成功构建了TK/gE双基因缺失株，该疫苗免疫动物后对猪、牛、羊均安全性较好[7]。我国彭大新等通过Cre/loxP系统成功构建了基于PRV-JSZ株的TK/gE双基因缺失株，并表现较好的安全性和保护力[8]。

1.2.2 TK-/gG-双缺失疫苗

该疫苗主要以TK-单缺失毒株为母本，进一步构建TK-/gG-双缺失毒株，该毒株对猪无致病性，但对牛、犬、猫毒性较强。该疫苗免疫猪后，对强毒株具有较好抵抗力。而且通过建立基于gG蛋白的ELISA方法可以区分野毒感染与疫苗接种。但该检测方法的灵敏度仍然不及基于gE蛋白的ELISA方法，因此一定程度限制了TK-/gG-疫苗的推广。不过我国华中农业大学陈焕春院士基于HB-98株所改进研制TK-/gG-双缺失疫苗目前国内市场反馈较好。

1.2.3 TK-/gC-双缺失疫苗

gC基因也可以作为该类疫苗区分野毒和疫苗毒的标记，有学者[9]以BUK-dl3株为亲本，进一步缺失了gC基因片段，构建了TK-/ gC-双缺失毒株，通过建立可建立基于gC蛋白的ELISA检测方法，可以达到鉴别野毒感染和疫苗接种的目的。但该疫苗免疫效果还有待进一步提高。

1.3 三基因缺失PRV疫苗

TK-/gE-/gI-三基因缺失苗：

我国学者郭万柱等[10]于2003年首次以TK-单缺失株的基础上成功构建了TK-/gE-/gI-三基因缺失株，而且该母本毒株是我国主要的流行毒株，疫苗通过进一步的安全性评估、免疫保护试验及进一步的临床试验证实该疫苗是一种安全性高、稳定性强、免疫效果好的疫苗，并已获新兽药证书。

1.4 四基因缺失PRV疫苗

选择更多基因的缺失，是大幅度降低PRV毒株的毒力的策略，而且可以有效降低疫苗的排毒率。

1.4.1 gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失苗

四基因缺失策略早在1990年国外学者已开展相关研究[11]，所构建的gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失株，能有效提高对仔猪的免疫保护水平，而且并未发现不良反应。

1.4.2 gD-/gE-/gI-/gG-四基因缺失苗

Mettenleiter等[12]在原有四缺苗的基础上，将gC-置换为gD-，并基于已改造的gD-稳定细胞系，成功构建了gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失株，进一步试验表明，该毒株的安全性显著提高，而且可以显著降低猪只的排毒水平。

2 小结与展望

动物疫苗研发从传统疫苗向基因工程疫苗发展将是未来整个行业的趋势，而且特别作为弱毒疫苗来说，标记疫苗更是解决如何区分野毒感染和疫苗接种的重要手段。而我国猪伪狂犬基因工程标记疫苗正是目前应用最为成功的动物标记疫苗。对推动其他疫病基因工程标记疫苗的研发和推广具有重大的指导意义。但该类疫苗仍然面临毒力返强、排毒抑制不彻底等问题，但随着我国动物疫苗研制水平的不断提升，同时完善猪伪狂犬病的综合防控体系，最终将实现我国根除该病的目标。

[1] An，T.Q.，Peng，J.M.，Tian，Z.J.，Zhao，H.Y.，Li，N.，Liu，Y.M.，Chen，J.Z.，Leng，C.L.，Sun，Y.，Chang，D.，Tong，G.Z.，2013.Pseudorabies virus variant in bartha-K61-vaccinated pigs，China[J].Emerg.Infect.Dis.，2012（19）：1749-1755.

[2] Wang，H.G.，Yang，D.Y.，Luo，X.F.，Zeng，Z.Y.，Li，C.Y.，Gan，Z.L.，Wang，F.，Liu，J.，Hao，F.，Research progress of mixed infections of classical swine fever and other diseases[J].Chin. Swine Indus，2013，（4）：56-58.

[3] Mettenleiter，T.C.，Lukacs，N.，Rziha，H.J.，Mapping of the structural gene of pseudorabies virus glycoprotein A and identification of two non-glycosylated precursor polypeptides[J].J.Virol.1985，（53）：52-57.

[4] 周复春，陈焕春，方六荣，等.伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定[J].中国兽医学报，1999，（5）：417-420.

[5] 苏鑫铭.伪狂犬病病毒上海株 TK 基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究[D].南京农业大学，2003.

[6] 陈瑞爱，邵定勇，韩静芳.猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK_&构建及其生物学特性[J].中国兽医学报，2010，30（5）：577-582.

[7] Van Oirschot J T，Terpstra C，Moormann R J M，et al.Safety of an Aujeszky's disease vaccine based on deletion mutant strain 783 which does not express thymidine kinase and glycoprotein I[J].Vet Rec，1990，127（10）：443-446.

[8] 梁苑燕，胡艳芬，张小荣，等.应用Cre-loxP 系统构建伪狂犬病病毒gE/TK双缺失株[J].畜牧兽医学报，2012，43（11）：1802-1809.

[9] Kit S，Pirtle E C.Attenuated properties of thymidine kinase negative deletion mutant of pseudorabies virus[J].Am J Yet Res，1985，46 （6）：1359-1367.

[10] 郭万柱，徐志文，王小玉，等.新型伪狂犬病病毒基因缺失株的构建及生物学特性研究（初报）[J].四川农业大学学报，2000，18（1）：1-3.

[11] Mettenleiter TC，Kem H，Rauh L Isolation of a viable herpesvirus （pseudorabies virus）mutant specifically lacking all four known nonessential glycoproteins[J].Virology，1990，179（1）：498-503.

[12] Mettenleiter TC，Klupp BG，Weiland F，et al.Characterization of a quadruple glycoprotein deleted pseudorabies virus mutant for use as a biologically safe live virus vaccine[J].J Gen Virol，1994，75（7）：1723-1733.

2016年度江苏省农业三新工程项目“生猪伪狂犬病综合净化技术”（项目编号：SXGC[2016]160）

姚海飞（1987—），男，南京农业大学动物医学本科毕业，农学学士，初级兽医师，执业兽医师，淮安市洪泽区动物疫病预防控制中心实验室负责人，主要从事动物疫病防控工作。