牛膝醇提物对兔骨关节炎软骨细胞体外增殖及糖胺聚糖的干预作用

肖伟++++++马笃军++++++彭力平++++++王立新++++++余阗++++++廖州伟++++++陈达++++++谭锐泉

[摘要] 目的 觀察牛膝醇提物对兔骨关节炎软骨细胞体外增殖及对糖胺聚糖（GAG）形成的影响。 方法 骨关节炎造模成功后提取、分离兔骨关节炎软骨细胞，用甲苯胺蓝染色确定软骨细胞的存在，将软骨细胞接种于5组：空白对照组、牛膝醇提物低剂量组、牛膝醇提物中剂量组、牛膝醇提物高剂量组、经典软骨增殖组。倒置相差显微镜观察软骨细胞形态，用CCK-8法检测软骨细胞增殖率，免疫细胞学检测Ⅱ型胶原蛋白荧光表达，qRT-PCR检测软骨细胞标记基因Ⅱ型胶原mRNA表达水平，邻联甲苯胺（DMB）染色法检测细胞内GAG含量。 结果 牛膝醇提物高、中、低剂量组与空白对照组比较Ⅱ型胶原蛋白荧光明显阳性表达；牛膝醇提物高、中剂量组与空白对照组比较软骨细胞标记基因Ⅱ型胶原mRNA明显增加（P < 0.05），其中牛膝醇提物高剂量组效果最佳（P < 0.01），与经典软骨增殖组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；空白对照组GAG含量与经典软骨增殖组及不同剂量牛膝醇提物组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），其中牛膝醇提物高剂量组GAG最多（P < 0.01），牛膝醇提物高剂量组与经典软骨增殖组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 牛膝醇提物中药含药血清可促进体外软骨细胞的增殖和蛋白合成，具体作用机制有待进一步探讨。

[关键词] 牛膝醇提物；软骨细胞；骨关节炎；增殖；糖胺聚糖

[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（b）-0020-05

[Abstract] Objective To observe the effects of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae on the proliferation in vitro and glycosaminoglycan （GAG） formation of chondrocytes in rabbits with osteoarthritis. Methods After successful establishment of osteoarthritis model， the chondrocytes in rabbits with osteoarthritis were extracted and separated， the exit of chondrocytes was determined by toluidine blue staining， the chondrocytes were inoculated into five groups： blank control group， low dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， median dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， classic cartilage proliferation group. The cellular morphology of chondrocytes was observed by inverted phase contrast microscope， the proliferation rates of chondrocytes were detected by CCK-8 method， the fluorescent expression of type Ⅱ collagen was detected by immunocytology， the expression of chondrocyte marker gene type Ⅱ collagen mRNA was detected by qRT-PCR， the contents of intracellular GAG were detected by DMB staining method. Results Compared with the blank group， fluorescent expression of type Ⅱ collagen in high， median， low dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups were positive； the expression of chondrocyte marker gene type Ⅱ collagen mRNA in high， median dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups were significantly increased compared with that of blank control group （P < 0.05）， among which， the effect of high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group was the best （P < 0.01）， which had no significant differences compared with that of classic cartilage proliferation group （P > 0.05）； the content of GAG in blank control group had significant differences compared with those of classic cartilage proliferation group and different dosages of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups （P < 0.05）， among which， the content of GAG in high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group was at most （P < 0.01）， there was no significant difference between high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group and classic cartilage proliferation group （P > 0.05）. Conclusion Serum containing alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae can promote the proliferation and protein synthesis of chondrocytes in vitro， the specific mechanism needs to be further studied.

[Key words] Alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae； Chondrocyte； Osteoarthritis； Proliferation； Glycosaminoglycan

骨关节炎（osteoarthritis）的核心病理改变是关节软骨的软化、破溃和脱落[1]，给社会带来了巨大经济负担，亟待研究解决。软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞成分，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型[2]。通过对古方和专业杂志的统计[3-4]，在治疗骨关节炎的中药中，牛膝的使用频率最高，笔者前期研究发现[1，5]，牛膝在体内能明显促进兔骨关节炎和急性软骨损伤模型软骨细胞增殖，提高软骨Ⅱ型胶原表达。故本研究拟在体外研究牛膝醇提物含药血清共培养干预兔软骨细胞的增殖及促进糖胺聚糖（glycos？鄄aminoglycan，GAG）的形成作用，现将结果报道如下： 1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DMEM∶F12（1∶1）（HyClone）；倒置相差显微镜（Leica）；胎牛血清（FBS，Gibico）；10%甲醛标本固定液（福尔马林液）；CO2培养箱（Heraeus）；IGF-1（Peprotech）；bFGF（Peprotech）；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（Gibco）；CCK-8试剂盒（C0037，碧云天）；TRE-Trizol（Invitrogen）；Primers（上海生工）；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）；BSA（牛血清蛋白，sigma）；Collagen Ⅱ抗体（（ab3092），abcam）；Cy3标记山羊抗小鼠IgG（广州易锦生物技术有限公司）；DAPI染液（碧云天生物研究所）；抗荧光衰减封片剂（碧云天生物研究所）；倒置荧光显微镜（DMI6000B，Leica）；85-2控温磁力搅拌器（XMTD-701，金壇市医疗器械厂）；牛膝醇提物（怀牛膝，深圳市中医院药剂科）等。

1.2 实验动物

健康新西兰兔56只，兔龄1～2个月，体重1.0～1.5 kg，雌雄不限，由广东省医学动物实验中心提供[动物合格证号：SCXK（粤）2014-0035]，适应性喂养1周后进行实验分组，随机将动物分配至空白对照组（4只）、骨关节炎模型组（52只）。造模6周后从骨关节炎模型组随机抽取4只实验兔与空白对照组4只兔进行比较，验证骨关节炎造模是否成功，再将48只骨关节炎模型组实验兔分为骨关节炎模型对照组、骨关节炎模型高剂量组、骨关节炎模型中剂量组、骨关节炎模型低剂量组，各12只。实验地址：深圳市中医药研究所，实验操作符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3 实验方法

1.3.1 骨关节炎动物造模、鉴定 按照马氏骨关节炎造模方法行实验兔右膝关节向前伸直位管型石膏固定，石膏外层缠绷带，肢体不用棉垫包裹，防止石膏易脱落，每天记录实验兔肢端血液循环、固定石膏稳定度、活动量等情况，固定6周后行骨关节炎模型鉴定[6]。

1.3.2 牛膝醇提物含药血清制备 《中国药典》2010年版牛膝常规高用量12 g，按照药理试验中动物与人体间的等效剂量进行换算，实验兔每日用量约1 g/kg。按照常规用药量的1、3、6倍，予骨关节炎模型低剂量组1 g/（kg·d）、骨关节炎模型中剂量组3 g/（kg·d）、骨关节炎模型高剂量组6 g/（kg·d），骨关节炎模型对照组0 g/（kg·d），每天灌胃2次，连续6周，每次灌胃时用蒸馏水配成10 mL。上述实验动物最后1次灌胃后2 h静脉采血，经灭活、过滤后分别配成10%含药血清DMEM∶F12（1∶1）培养液和10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培养液作为条件培养液。

1.3.3 软骨细胞分离、培养 实验兔麻醉后，无菌切取骨关节炎模型对照组关节软骨，经冲洗、剪碎、蛋白酶消化后收集离心得到的软骨细胞团块后，加入培养液稀释制成单细胞悬液并行原代培养。细胞爬片后用甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞的存在。待细胞生长密度达70%～80%时消化传代，以倒置相差显微镜观察体外培养软骨细胞形态，利用CCK-8法检测软骨细胞增殖，酶联免疫检测仪在450 nm双波长处测得相应OD值，绘制细胞生长曲线。

1.3.4 软骨细胞体外分组培养、含药血清干预 取第2代软骨细胞，在含10%胎牛血清的DMEM∶F12（1∶1）培养液中培养培养1周，换液2次。从第2周起随机用牛膝醇提物不同剂量组10%含药血清、10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培养液和含胰岛素样生长因子-1（IGF-1）10 ng/mL+碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）10 ng/mL 10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培养液，继续培养2周，每日用倒置显微镜观察细胞形态变化并摄片。分别于诱导的第3、6、9、12天进行CCK-8检测，方法同上。具体分组如下，空白对照组：10%胎牛血清+10%空白血清+DMEM∶F12（1∶1）培养液；牛膝醇提物高剂量组：10%胎牛血清+10%高剂量含药血清+DMEM∶F12（1∶1）培养液；牛膝醇提物中剂量组：10%胎牛血清+10%中剂量含药血清+DMEM∶F12（1∶1）培养液；牛膝醇提物低剂量组：10%胎牛血清+10%低剂量含药血清+DMEM∶F12（1∶1）培养液；经典软骨增殖组：10%胎牛血清+10%空白血清+IGF-1 10 ng/mL+bFGF 10 ng/mL + DMEM∶F12（1∶1）培养液。

1.3.5 免疫细胞学检测Ⅱ型胶原蛋白荧光表达 制备空白对照组及实验组细胞爬片，按照免疫组化试剂盒说明添加抗体，然后显色，脱水，透明，封片，计算阳性率。

1.4 qRT-PCR引物设计、检测软骨Ⅱ型胶原表达

采用Primer 3.0设计Real Time PCR引物，引物序列经NCBI nBlast比对无非特异性扩增，用于qRT-PCR实验。该实验目的基因Ⅱ型胶原（ID100009005）引物序列（5' to 3'）：Forward TGTGAACTGGTAGATCTGGT；Reverse AAGAAGTGGAATAAGTGGGCT。分别收集空白对照组与实验组细胞，将软骨细胞培养21 d后，提取软骨细胞总RNA，再用随机引物，逆转录酶转录为cDNA，然后以此cDNA第1链为模板，进行qRT-PCR扩增。

1.5 GAG含量测定

使用DMB染色法试剂盒检测细胞内GAG含量，使用24孔培养板培养细胞。首先测定吸光值：细胞裂解液裂解细胞，加入DMB显色剂，于525 nm波长处比色，测定吸光值；制作标准曲线：硫酸软骨素作标准溶液，加入DMB显色剂，测定吸光值，做出标准曲线[7]。两组曲线相互对比，求出GAG浓度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，不满足方差分析时用非参数检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨细胞培养及增殖曲线

原代细胞刚接种时形态主要为梭形或圆形，培养24 h后细胞开始贴壁生长，48 h后基本全部贴壁生长，分布稀疏。培养3～4 d后细胞增殖加快，体型呈多边形（图1）。随着传代次数增多，细胞增殖活性下降，形态多样，传至P5后软骨细胞出现细胞碎片增多、形态扁平等老化现象，增殖减慢。选择CCK-8法观察P1、P3、P5传代细胞生长曲线，绘制的生长曲线符合Logistic生长曲线规律。传代第1～2天为生长潜伏期，第3～6天为对数增殖期，对数增殖期结束后进入平台期和下降期。P1～P3代细胞增殖能力基本相同，P5代细胞生长速度略低于P3。细胞的增殖能力随传代次数增加而开始减弱（圖2）。

2.2 免疫细胞学检测软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达

连续培养14 d后，空白对照组（图3a，封四）轻度Ⅱ型胶原荧光染色，牛膝醇提物高剂量组（图3b，封四）和经典软骨增殖组（图3c，封四）Ⅱ型胶原荧光染色明显阳性，说明经典软骨增殖组和牛膝醇提物高剂量组软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原蛋白明显表达。

2.3 软骨细胞qRT-PCR结果

qRT-PCR检测结果分析表明，与空白对照组比较，牛膝醇提物高、中剂量组及经典软骨增殖组软骨标记基因Ⅱ型胶原表达量均明显增加（P < 0.05），其中牛膝醇提物高剂量组软骨细胞标记基因Ⅱ型胶原表达量最多（P < 0.01）。牛膝醇提物低剂量组Ⅱ型胶原表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

2.4 软骨细胞GAG含量测定

空白对照组GAG含量与经典软骨增殖组及不同剂量牛膝醇提物组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），其中高剂量组GAG最多（P < 0.01），牛膝醇提物高剂量组与经典软骨增殖组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图5。

3 讨论

关节软骨受组织学和生物学特性的限制，骨组织中未分化的间充质细胞不能进入损伤部位，软骨破坏后自然修复的组织为纤维软骨，缺乏原正常透明软骨的耐用性及力学功能，如何修复病损的关节软骨是目前骨关节炎研究的重点和难点。

组织工程利用中药修复组织损伤性疾病的研究逐年增加，一些补肝肾、强筋骨类中药能够促进软骨的形成[8-10]，而牛膝是治疗软骨损伤性疾病如骨关节炎的使用频率最高的中药。牛膝有效成分有多糖类、皂苷类、甾酮类、黄酮类等，与其“补肝肾，强筋骨”功效相关的研究有：多糖类具抗氧化、抗细胞凋亡等作用[11]，汪巍[7]研究证实多糖类具有促进软骨细胞合成GAG的作用，与本研究结果相符合，皂苷类具有促进软骨增殖的作用，蜕皮甾酮具有促进蛋白质的合成、使受损细胞再生等作用，乙醇提取物能促进软骨细胞增殖，增加Ⅱ型胶原表达[12]，与本研究体外培养有效促进软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原表达相符合。

多种信号通路参与软骨细胞生长、成熟过程。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是细胞的能量感受器，可通过感受能量变化（AMP上升，ATP下降）的程度而被激活。研究发现Wnt/β-catenin通路在软骨细胞成熟、增殖、凋亡等方面起着重要作用，并对软骨外基质分解代谢亦有着重要的作用，可通过环氧化酶（COX-2）、白细胞介素（IL）、骨形态发生蛋白（BMP2）、基质金属蛋白酶（MMPs）值变化来影响软骨代谢。本研究过程中牛膝醇提物组有效促进了软骨细胞体外增殖，软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光强表达，并且GAG分泌量明显增多，因此Wnt/β-catenin通路很可能参与其中。陈达等[13]用牛膝醇提物对兔骨关节炎模型灌胃后发现，牛膝醇提物组较空白对照组能明显降低血液和关节液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1β及MMP-3等炎症介质的含量。因此认为Wnt/β-catenin信号通路是骨关节炎软骨破坏病程中最重要的信号通路之一，也可能是牛膝醇提物有效促进软骨细胞增殖和抗凋亡的作用机制之一。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路调节特定的基因表达来参与细胞增殖、分化、转化及凋亡等多种细胞的生理过程，是胞外信号引起细胞核反应的共同通路。MAPK被证实在炎症因子引起软骨细胞MMPs表达增高的过程中起了重要作用。马钢等[14]报道，Caspase-3蛋白在骨关节炎软骨细胞的凋亡过程中扮演着重要的作用。同样PI3K/Akt信号途径的正常表达对软骨细胞的增殖、分化也具有不可替代的作用[15]。由此可见，软骨增殖、成熟的过程中，有多条信号通路参与其中，这些信号通路互相交织，在软骨细胞增殖的进程担负着不同的作用。

中药构建软骨组织工程的研究是一个崭新的研究领域，许多中药（包括牛膝）能够有效地参与成骨活动，并有较高的诱导率、安全性，其中牛膝醇提物属于单味中药怀牛膝的浓缩醇提物混合制剂，含有牛膝多种有效成分，具有“组合分化”的特性，比单体药物制剂作用更加广泛。研究表明，多糖类具有激活p38MAPK信号通路上调促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的作用[16]；皂苷类具有降低Wnt通路β-catenin蛋白的磷酸化来下调β-catenin mRNA的表达和抑制

Wnt信号通路，下调TGF-β1表达发挥抑制系膜细胞增殖[17]；甾酮类可通过激活ERK/MAPK信号通路增加细胞抗氧化作用而发挥促进细胞增殖[18]；黄酮类能调控抑制Wnt通路β-catenin蛋白来改善类风湿性关节炎模型大鼠滑膜组织炎症状态[19]，以及通过抑制AMPK通路NF-κB向细胞核转移，导致细胞核内NF-κB的表达水平降低而抑制炎症因子IL-6的分泌[20]。因此，进一步研究这种信号通路相互作用的生物网络机制，明确牛膝醇提物在促進软骨细胞增殖中，不同分子对其作用的机制，将有助于我们找到治疗骨关节炎的靶点，AMPK/Wnt/MAPK信号通路串话可能是牛膝醇提物对骨关节炎软骨修复作用的信号交互通路之一。

[参考文献]

[1] 彭力平，马笃军，林栋栋，等.牛膝醇提物体内诱导兔骨关节炎模型软骨修复的病理学观察[J].湖南中医杂志，2013，29（2）：126-129.

[2] 李西海，梁文娜，刘献祥，等.端粒和端粒酶与永生化软骨细胞[J].国际骨科学杂志，2007，28（6）：351-352.

[3] 郭达，张斌山，刘金文.骨关节炎的古代方药规律研究[J].南方医科大学学报，2010，30（9）：2194-2195.

[4] 姚共和，刘向前，李建斌，等.中医期刊治疗膝关节骨关节炎方剂用药特点分析[J].湖南中医学院学报，2005，25（6）：54-56.

[5] 彭力平，马笃军，裴军宇.牛膝醇提物对急性软骨损伤兔软骨的影响[J].中医杂志，2013，19（54）：1504-1506.

[6] 曾俊华，马笃军，彭力平，等.实验兔膝骨关节炎模型的建立及鉴定[J].中国临床研究，2016，29（5）：679-682.

[7] 汪巍.甘草多糖对大鼠骨关节炎软骨细胞糖胺多糖合成影响及其作用机制的研究[D].武汉：武汉大学，2012.

[8] 史红逸，赵赞，林琳，等.补肾益气活血方对人骨关节炎软骨细胞增殖及相关细胞因子的干预作用[J].河南中医，2015，35（1）：99-101.

[9] 刘渊，孙雪莲，周红海，等.牛膝总皂苷含药血清对兔膝软骨细胞增殖与凋亡的实验研究[J].时珍国医国药，2015，26（10）：2382-2385.

[10] 张君涛，王平，杨光，等.仙灵骨葆胶囊含药血清对兔软骨细胞增殖及分泌功能的影响[J].中华中医药杂志，2016，31（4）：1479-1482.

[11] Shen Y，Zhang Q，Gao X，et al. An active fraction of Achyranthes bidentata polypeptides prevents apoptosis induced by serum deprivation in SH-SY5Y cells through activation of PI3K/Akt/Gsk3 path-ways [J]. Neurochem Res，2011，36（11）：2186-2194.

[12] 李成付，王玖忠，边瑜健，等.牛膝醇提物促进兔骨关节炎软骨修复的作用及其机制的实验研究[J].中国临床研究，2015，28（7）：844-877.

[13] 陈达，廖州伟，马笃军，等.牛膝醇提物对兔骨关节炎模型的疗效比较[J].中国医药导报，2016，13（25）：21-24.

[14] 马钢，崔珈衔，任明姬.Caspase-3、Caspase-12与骨性关节炎软骨细胞凋亡的关系[J].中国实用医药，2014，9（35）：224-225.

[15] 杨安群，谢获.当归-牛膝对兔骨关节炎PI3K/AKT通路的影响[J].放射免疫学杂志，2012，25（5）：526-529.

[16] 李丹青，肖强兵.巴戟天多糖通过p38 MAPK信号通路促间充质干细胞成骨分化的体外研究[J].中国中医骨伤科杂志，2015，23（5）：1-4.

[17] 孙雪艳，杨丽平，占永立，等.薯蓣皂苷抑制脂多糖刺激的大鼠系膜细胞增殖及对Wnt通路的影响[J].中华中医药杂志，2014，29（3）：871-874.

[18] 张可丽，黄秀榕，祁明信，等.蜕皮甾酮和异补骨脂素在HLEC中抗氧化损伤的信号转导机制[J].国际眼科杂志，2012，12（11）：2072-2074.

[19] 缪成贵，刘健，张永和，等.滁菊总黄酮调控类风湿性关节炎模型大鼠滑膜组织Wnt通路SFRP4表达[J].中南大学学报，2013，38（7）：715-721.

[20] 何标，廉果.槲皮黄酮对AMPK/NF-κB信号通路介导IL-6表达的影响[J].广东药学报，2016，32（5）：634-638.