植物源农药丁子香酚与苦参碱及其混配对葡萄灰霉病的毒力测定及田间防效

杨勇++王建华++吉沐祥++吴祥++陈宏州+李国平

摘要：为筛选防治葡萄灰霉病的高效低毒新型植物源复配杀菌剂，降低有效用药量，提高防治效果，减少和替换对葡萄灰霉病菌产生抗药性的一些常用化学杀菌剂。采用菌丝生长速率法测定植物源农药丁子香酚、苦参碱及其混配制剂对葡萄灰霉病菌的毒力，并通过田间试验评价其对葡萄灰霉病的防治效果。结果表明，丁子香酚与苦参碱及 6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3、1 ∶[KG-*3]6混配组合对葡萄灰霉病菌的EC50（半最大效应浓度）值分别为1.454 7、357.536 9、0.384 8、0.757 5、1.312 0、2.087 3、4.960 1 μg/mL；5种混配组合对葡萄灰霉病菌的增效系数（SR）分别为4.41、2.56、2.21、2.75、2.00，几种配比均具有明显增效作用，其中以6 ∶[KG-*3]1混配的组合增效系数最大。田间防效调查结果表明，0.5% 丁子香酚可溶液剂250倍液+1.3%苦参碱水剂500倍液（高浓度）、0.5%丁子香酚可溶液剂375倍液+1.3%苦参碱水剂750倍液（中浓度）、0.5%丁子香酚可溶液剂500倍液+1.3%苦参碱水剂1 000倍液（低浓度）、0.5%丁子香酚可溶液剂250倍液、1.3%苦参碱水剂500倍液对葡萄灰霉病防治效果分别为86.31%、67.03%、55.34%、8014%、57.73%。丁子香酚和苦参碱6 ∶[KG-*3]1～1 ∶[KG-*3]6混配对葡萄灰霉病菌均增效明显，果穗套袋前采用0.5%丁子香酚可溶液剂250倍液+1.3%苦参碱水剂500倍液混用浸果处理后套袋，采收前调查对葡萄灰霉病害防效为85%以上，明显优于各单剂和中、低浓度混配处理的防效。

关键词：葡萄灰霉病；丁子香酚；苦参碱；复配；抑制活性；田间防效

中图分类号：S436.631.1+9文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0160-04

收稿日期：2016-05-16

基金项目：国家科技富民强县专项（编号：BN20156222）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（14）2056]。

作者简介：杨勇（1990—），男，安徽宣城人，硕士，研究实习员，主要从事果树栽培与植保研究。Tel：（0511）80978060；E-mail：yl0656@163.com。

通信作者：吉沐祥，研究员，主要从事果树植保与农药开发研究。Tel：（0511）80978060；E-mail：jilvdun2800@163.com。

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）引起的真菌病害，腐生性強、寄主广泛，已报道的就超过200种。在葡萄生产上，灰霉病是常见病害，也是最严重的病害之一，每年因灰霉病造成的葡萄损失为20%左右，发病严重的果园损失高达50%[1]。该病主要侵染葡萄的花冠、花序、果实、叶片及新梢，同时也会对贮藏期的葡萄造成严重危害，如何有效控制灰霉病的发生成为葡萄产业的当务之急。

目前对葡萄灰霉病的防治大多还是使用化学药剂，然而灰葡萄孢菌具有高基因漂移潜力、种群尺度较大、繁殖速度快、遗传变异大、适合度高[2-4]，加之用药不科学，多年持续使用单一药剂，造成灰霉病菌对一些杀菌剂（苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类）产生了抗药性，甚至出现多重抗药性，导致药剂对葡萄灰霉病的田间防效大幅下降，给病害防治带来很多困难[5-6]。灰霉病菌对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类及氨基甲酸酯类农药的多重抗药性类型有RRS型（R表示抗，S表示感，RRS即为对前2类杀菌剂已有抗药性而对后1类尚敏感）、RSS型、SSR型和RRR型，前人研究发现，我国各地区葡萄灰霉病菌对3类药剂出现不同程度的抗药性，对苯并咪唑类的抗药性已普遍存在[7]。丁子香酚是存在于桃金娘科丁子香属植物丁香（Eugenia caryophyllato Thunb）中的一种有香味的挥发性物质。20世纪90年代，国内首次将丁子香酚研发作为蔬菜等作物的杀菌剂[8]，作为治疗性杀菌剂，丁子香酚具有杀菌谱广、毒性低的特点，能迅速治疗多种农作物、水果感染的真菌、细菌性病害[9-11]，如灰葡萄孢菌、腐霉菌、镰刀菌、双疫霉菌等[12]。苦参碱是由苦参的根、茎、叶和果实经乙醇等有机溶剂提取制成，主要成分为生物碱和黄酮类，被广泛应用于临床医学。近年来，国内逐渐开发出苦参碱农药，应用于防治果蔬、茶叶、烟草等作物的病虫害，并取得了良好防效[13]。[JP2]丁子香酚与苦参碱作用机理各异，2种药剂复配既具有保护作用又具有治疗作用，或许有利于克服或延缓葡萄灰霉病菌抗药性的发展，提高防治效果。为了进一步明确丁子香酚和苦参碱混配对控制葡萄灰霉病菌是否具有增效作用，本试验进行了丁子香酚和苦参碱的混合物联合毒力测定，通过田间药效试验评价了2种制剂混用对葡萄灰霉病的防治效果，旨在明确丁子香酚与苦参碱混配对葡萄灰霉病的毒力及合理配比，以及田间对葡萄果穗灰霉病的实际防效，为减少和替代化学农药，防止化学抗药性和残留，提高果品安全品质，寻求有效防治葡萄灰霉病的生物产品提供依据。

1材料与方法

1.1室内抑菌活性测定

1.1.1试验时间与地点于2014年4—7月在江苏丘陵地区镇江农业科学研究所现代农业研究室实验室进行。

1.1.2供试菌株葡萄灰霉病菌，采自江苏省句容市华阳镇葡萄园，由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所植保研究室分离、鉴定、保存备用。菌株保存于马铃薯蔗糖琼脂（PSA）斜面上（4 ℃）。

1.1.3供试药剂20%丁子香酚（eugenol）水剂（江苏剑牌农化股份有限公司）；5%苦参碱（matrine）母药（北京三浦百草绿色植物制剂有限公司）；1.3%苦参碱水剂（山西德威生化有限责任公司）；0.3%丁子香酚可溶液剂（江苏省南通神雨绿色药业有限公司）。

1.1.4仪器设备电子天平（感量0.1 mg）、GZP-300A培养箱、直径为75 mm的培养皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接种刀等。

1.1.5试验方法

1.1.5.1药液的配制及浓度设计（1）母液配制：将20%丁子香酚水剂和5%苦参碱母药用适量丙酮溶解后加10%吐温80，配制成1 000 μg/mL母液置于4 ℃冰箱中备用。

（2）各药剂单剂与复配剂的浓度设计：丁子香酚在含药PSA培养基中的有效成分浓度设计为：50.000 000、25.000 000、12.500 000、6.250 000、3.125 000、1.562 500、0.781 250、0390 625 μg/mL；苦参碱在含药PSA培养基中的有效成分浓度设计为：100.000 00、50.000 00、25.000 00、12.500 00、6.250 00、3.125 00、1.562 50、0.781 25 μg/mL；丁子香酚 ∶[KG-*3]苦参碱（6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3和1 ∶[KG-*3]6）混配在含药PSA中的有效成分浓度设计均为：50.000 000、25.000 000、12.500 000、6.250 000、3.125 000、1.562 500、0.781 250、0.390 625 μg/mL。单剂与混配剂的有效成分浓度设计均为7个不同浓度梯度含药PSA培养基。

除母液外，所有试验药剂系列有效成分浓度的药液均为现配现用。

1.1.5.2杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内毒力测定采用菌丝生长速率法[14]，将各单剂与混配剂的药液依次稀释至所需浓度，然后将1 mL药液与9 mL培养基在培养皿内混匀，制成含系列浓度药剂的PSA培养基，采用无菌水作空白对照，各处理重复4次。将保留的葡萄灰霉病菌转接到PSA平皿中，在25 ℃下活化72 h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并转接到含药的PSA平皿和空白对照中。25 ℃ 培养96 h，待对照中菌落约长至平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。

计算菌落直径均值，并按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率：

菌丝生长平均抑制率=[（对照菌落直径均值-处理菌落直径均值）/（对照菌落直径均值-接种菌饼直径）]×100%。取抑制率在5%～95%的数据，采用DPS 13.0专业版数据处理系统，计算出药剂对葡萄灰霉病菌菌丝生长抑制的回归方程、EC50及其95%置信限。

1.1.5.3联合作用评价方法根据Wadley法[14]，计算增效系数（SR）。根据增效系数评价药剂混用的联合作用类型，即SR<0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用。

[JZ（]SR=EC50（Eth）/EC50（Eob）；[JZ）][JY]（1）

[JZ（]EC50（Eth）=（a+b）/[（a/EC50A）+（b/EC50B）]。[JZ）][JY]（2）

式中：A、B分别为丁子香酚和苦参碱单剂；EC50A、EC50B分别为丁子香酚和苦参碱单剂的EC50值；a、b分别为丁子香酚和苦参碱单剂在混剂中的比例；EC50（Eth）为混剂EC50理论值；EC50（Eob）为混剂EC50实测值。

1.2杀菌剂对葡萄灰霉病的田间防效试验

田间试验于2015年在句容市华阳镇下甸村农户葡萄园进行，葡萄品种为夏黑，树龄5年，栽培方式为篱架。试验设0.5%丁子香酚可溶液剂250倍液+1.3%苦参碱水剂500倍液、0.5%丁子香酚可溶液劑375倍液+1.3%苦参碱水剂750倍液、0.5%丁子香酚液500倍液+1.3%苦参碱1 000倍液（以下分别简称高浓度、中浓度、低浓度）、0.5%丁子香酚250倍液、1.3%苦参碱500倍液及清水对照6个处理，每处理重复3次，随机区组排列，每小区供试葡萄树3株。

果粒直径约为1 cm时选择晴好天气上午浸果处理，当天下午套袋，果实成熟后摘袋调查病果率。每个处理取10个果穗，记录调查总果粒数、病果粒数，计算病果率及防治效果。

葡萄灰霉病以病果率表示各处理区的发病情况。

[JZ]病果率=（病果数/调查总果数）×100%；

防治效果=（对照区病果率-处理区病果率）/对照区病果率×100%。[JY]（3）

2结果与分析

2.1室内抑菌活性测定研究

2.1.1丁子香酚与苦参碱对葡萄灰霉病病菌菌丝生长的抑制作用从表1可看出，当丁子香酚的浓度为0.390 625～50.000 000 μg/mL时，对葡萄灰霉病病菌菌丝生长的抑制率为 29.15%～93.47%；当苦参碱药剂处理浓度为0.781 25～100.000 00 μg/mL 时，对葡萄灰霉病病菌菌丝生长的抑制率为 6.03%～38.19%。这表明2种杀菌剂对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制活性以及对葡萄灰霉病菌菌丝生长的最低抑制浓度（MIC值） 有差异。

2.1.2丁子香酚与苦参碱混配对葡萄灰霉病病菌菌丝生长的抑制作用从表2可看出，丁子香酚与苦参碱混配组合不同处理浓度对灰霉病菌表现不同程度的抑制作用。丁子香酚与苦参碱5种混配组合的浓度为0.390 625～50.000 000 μg/mL 时，6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3和1 ∶[KG-*3]6配比的混配组合对葡萄灰霉病病菌菌丝生长的抑制率分别为5276%～91.46、44.22%～90.45%、34.67%～87.44%、2613%～84.92%、18.09%～81.41%。表明丁子香酚与苦参碱混配组合不同处理浓度对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制活性和最低抑制浓度（MIC值）有较大差异。

2.1.3丁子香酚、苦参碱及其混配剂对葡萄灰霉病病菌的毒力测定2种单剂和5种复配组合对葡萄灰霉病病菌的作用模型见表3，浓度对数与防治效果概率值的相关系数均 ≥0.991 7，说明防治效果概率值的变异有99.17%或以上来自浓度对数的变异，[JP2]表明用所得模型表达浓度对数与防治效果概率值的关系可行。表3数据表明，丁子香酚、苦参碱单剂对葡萄灰霉病病菌的EC50分别为1.454 7、357.536 9 μg/mL，丁子香酚对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制活性高于苦参碱。从表3中也可看出，丁子香酚与苦参碱分别以质量比6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3 和1 ∶[KG-*3]6混配后对葡萄灰霉病菌菌丝生长抑制的EC50分别为0.384 8、0.757 5、1.312 0、2.087 3、4.960 1 μg/mL，丁子香酚与苦参碱分别以质量比6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1和1 ∶[KG-*3]1混配后对灰霉病菌的抑制作用均强于各单剂；5种混配组合对葡萄灰霉病菌的增效系数（SR）分别为4.41、2.56、2.21、2.75和 2.00，根据 Wadley评价法，增效系数（SR）均大于1.5，表现出增效作用，其中以质量比6 ∶[KG-*3]1混配，增效系数（SR）最高，为4.41。因此，从整体上判断丁子香酚和苦参碱混配剂对葡萄灰霉病病菌的抑制作用较好，并且推荐的最佳混配比为 6 ∶[KG-*3]1。

2.2田间防治效果试验

为了进一步验证丁子香酚和苦参碱混用组合对葡萄灰霉病的防治效果，特进行了田间防治效果试验。从药后50 d采摘前调查对葡萄灰霉病病粒防治效果（表4）可以看出，混用组合高浓度防效为86.31%，显著高于2个单剂和混用组合中浓度及低浓度，而0.5%丁子香酚可溶液剂250倍液单剂对灰霉病的防效也达到了80%以上，显著高于混合组合中、低浓度。因此，葡萄灰霉病防治效果，以高浓度混用组合最优，0.5%丁子香酚可溶液剂250倍液对套袋前浸果处理也有较好防效。

2.3安全性调查

套袋前浸果处理施药后的10、30、50 d（采收时）拆袋目测观察，各处理区葡萄果实生长发育正常，无明显药害或药斑，表明供试药剂在试验剂量范围内对葡萄果穗安全。

[BT1#]3结论与讨论

灰霉病是广泛分布于全世界葡萄种植国家和地区的重要病害，它严重影响了葡萄的产量和质量。传统防治灰霉病的药剂如腐霉利、嘧霉胺、多菌灵、百菌清等由于使用频繁，灰霉病菌部分药剂已产生抗药性，防效较差。严红等通过检测葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类杀菌剂的抗药性发现，葡萄灰霉病菌对多菌灵的抗药性严重，为83.5%，对腐霉利和乙霉威的抗药性频率分别为14.7%和17.4%，[JP2]抗药性处于发展阶段[7]。张玮等研究表明，中国葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性频率为22.22%～62.50%，抗药性普遍，并与多菌灵、腐霉利、乙霉威均存在交互抗药性[15]。

本研究采用室内毒力测定与田间药效试验相结合的方法，测试了丁子香酚、苦参碱及其混配组合对葡萄灰霉病的防治效果。试验结果表明，通过室内毒力测定，丁子香酚和苦参碱对葡萄灰霉病菌均具有抑菌活性，其中丁子香酚对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制活性明显高于苦参碱。在单剂毒力的基础上，结合不同杀菌剂的作用机理，选择丁子香酚和苦参碱进行不同配比的毒力测定。试验发现5个配比（6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3、1 ∶[KG-*3]6）均表现为明显增效作用，其中丁子香酚、苦参碱6 ∶[KG-*3]1混配对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制活性最好，增效作用最高。将筛选出的新型混剂进行田间小区试验，将丁子香酚和苦参碱进行不同稀释倍数混配处理。结果表明，0.5% 丁子香酚250倍液+1.3%苦参碱500倍液，对葡萄灰霉病的防效达到了85%以上，室内毒力测定与田间药效试验结果基本相符，室内表现抑菌效果较好的混配剂组合在田间防效最高。在试验浓度条件下浸果处理该药剂对葡萄果穗安全，无药害发生。因此，丁子香酚和苦参碱混配可作为生产上防控葡萄灰霉病的植物源新药剂。

由此可见，植物源农药丁子香酚和苦参碱复配或混用防治葡萄灰霉病可行，研究结果为生产中减少和替代化学农药，减少化学农药残留和提高葡萄安全品质提供了试验依据，从而为葡萄病害的防治提供了新方法，具有较好的应用前景，但在对叶部和花穗灰霉病及其他病害防治等方面还有待进一步研究。

[HS2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

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