生物样品中佐匹克隆检测分析进展

舒翠霞 ，龚 丹，张蕾萍 ，赵嘉祥

（1.苏州市公安局，江苏 苏州 215131；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038）

佐匹克隆又名忆梦返，为环吡咯酮类催眠药，1987年在法国首次上市，1990年进入我国市场。随着这种药物在临床上的广泛应用，利用佐匹克隆实施麻醉抢劫、迷奸、凶杀等案件时有报道[1-3]，也有误服或口服佐匹克隆自杀的事件发生[4-6]。因此，快速、准确测定生物样品中佐匹克隆成分在侦查办案过程中对确定案（事）件性质、分析作案手段、提供诉讼证据等方面具有不可替代的作用。目前，佐匹克隆的检测方法有紫外分光光度（UV）法[7]、荧光分光光度法[8-9]、气相色谱（GC）法[10-13]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）法[14-16]、高效液相色谱（HPLC）法[17-19]和液相色谱-质谱联用（LC-MS）法[6，20-24]等，本文在全面介绍不同生物样品中佐匹克隆提取净化方法的基础上，重点介绍已广泛应用的检测分析方法。

1 生物检材

血液和尿液是最常见的生物检材，目前关于佐匹克隆的研究报道主要集中于血清、血浆、全血和尿液中佐匹克隆检测分析，也有少数关于肝组织、脑组织等生物检材中佐匹克隆的检测分析报道。尿液检测时限比血液、血浆检测时限长，对于治疗剂量的佐匹克隆，血液的检测窗口时长为6～20 h，尿液约为24～48h[25-26]，虽然现在还缺乏更确切的数据，但此窗口可能会随着药物的摄取量和中毒情况而增加。在药物犯罪中，可能会使用高剂量药物，血液中佐匹克隆检测的最大时间窗可达到48h，尿液为72h[27]。

一些超过血液和尿液最大检测时限的案件中，毛发、指甲可作为一种重要的补充样品进行目标物检测分析[1]。由于毛发、指甲取样量少，因此有关毛发、指甲中目标物检测一般采用灵敏度高的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法[25-28]。毛发样品一般在案发后1个月采集[1]。有文献[29]报道，唾液可反映近期摄药史，但其存在取样量不足，易受食品、饮料等干扰以及含药量低等不足之处[30]。

2 提取方法

国内外关于生物样品中佐匹克隆提取方法的报道，主要集中于液液萃取[17，21，31]、固相萃取[10，14，20，22]和沉淀蛋白-直接提取法[6，14]。沉淀蛋白法一般采用乙腈作为蛋白沉淀剂，直接提取后供高效液相色谱或高效液相色谱-质谱联用检测，该方法主要适用于血、肝等生物样品的处理。而液液提取法则适用于多数生物样品，直接采用乙醚、乙酸乙酯或正丁基氯进行提取，回收率分别在78.6%、78.9%和73.4%以上，也有将生物样品先碱化后再用有机溶剂提取的报道[11，19，23]。ELIASSEN等[23]向100 μL血样中添加pH=11的硼酸盐缓冲液75μL，再用 1.2mL 的 V（乙酸乙酯）∶V（正庚烷）=80∶20提取，低、中、高浓度的回收率均大于70%。STANKE等[11]向1 mL血样中添加pH=9.2的碳酸盐缓冲液2mL，再用 4mL V（己烷）∶V（二氯甲烷）=4∶3 提取，回收率大于82.5%。

毛发样品先用二氯甲烷清洗2次，分成2cm的片段，每个片段分别剪成小于1mm的碎末，浸泡于pH=8.4的磷酸缓冲液中，最后用V（二氯甲烷）∶V（乙醚）=80∶20进行液液萃取，提取回收率可达91.9%[3]。

佐匹克隆的固相萃取研究中多数采用亲水亲脂的 HLB 固 相 萃 取 柱[10，14，20，22]，MISTRI 等[22]用 0.05%甲酸稀释血液后过柱，低、中、高浓度的回收率均大于90.8%。有报道[10]用pH=7.4的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液稀释血液，低、中、高浓度的回收率均大于88.7%。有报道[20]酸性条件下佐匹克隆经HLB柱固相萃取回收率明显好于碱性条件，随着pH值增大，回收率逐渐下降，在pH=5时回收率达最大值。TONON等[32]采用C18固相萃取脑组织中的佐匹克隆，该处理方法先将脑组织与pH=6的磷酸钠缓冲液混合后匀浆，稀释后离心，取上清液上样，方法的回收率可达91.7%。郭璟琦等[20]认为，固相萃取比液液萃取对血液样品的提取效果更好，回收率高，杂质干扰少，稳定性和重现性好。

近年来，有人研发了分散液液微萃取提取液体察氏培养基中的佐匹克隆及其代谢物[33]，该研究用pH=9.5的盐酸-Tris缓冲液调节培养基的pH值，三氯甲烷（100 μL）作为萃取剂，甲醇（300 μL）为分散剂，佐匹克隆的回收率可达82%。该方法较传统的萃取方法快速、简单，溶剂消耗少，回收率好。

3 检测方法

3.1 气相色谱法和气相色谱-质谱联用法

佐匹克隆的检测常用气相色谱结合微量池电子捕获检测器（GC-μECD）[12]或氮磷检测器[10-11]，由于GC-μECD对被测物具有极强的选择性，佐匹克隆分子中含有强电负性基团Cl-，因此采用GC-μECD检测具有极高的灵敏度，最低检出限为0.02μg/mL。同样由于氯原子的存在，佐匹克隆不仅适用气质联用电子轰击源分析，也适用于气质联用负化学源分析。有报道[14]对这两种检测器进行比较，结果显示，佐匹克隆在电子轰击源上的检出限是0.2 μg/mL，而负化学源上的检出限是0.03μg/mL，在减少色谱图中杂质干扰方面负化学源也占有较大优势。

气相色谱和气相色谱-质谱联用法测定佐匹克隆，一般均采用毛细管柱和程序升温法，如采用毛细管柱200℃保持1min，以20℃/min升至280℃（保持15min），或 240℃保持 1min，以 10℃/min升温至 290℃（保持20min）。佐匹克隆的降解温度为普通气相色谱程序升温法中的临界温度[34]，所以不能用普通气相色谱程序升温法或普通气相色谱程序升温法的气相色谱-质谱联用法测定。

3.2 高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱法测定生物样品中佐匹克隆多采用等度洗脱法。一般情况下，样品中的佐匹克隆与杂质都能得到较好的分离[17，19，35-36]。高效液相色谱柱常采用反相 C18填料[17，19，35]，流动相体系有 20mmol/L V（乙酸钠缓冲液，pH=6.0）∶V（乙腈）∶V（甲醇）=67∶24∶9[17]、V（乙腈）∶V（水）∶V（0.5mol/L 磷酸二氢钠）=25∶72∶3[19]、V（0.02mol/L 磷酸二氢钾）∶V（甲醇）=38∶62[35]、V（磷酸二氢钠）∶V（甲醇）=45∶55[37]等，流动相的 pH 值常采用磷酸盐调节。由于生物样品成分复杂、杂质多，对检测器的要求比较高，而佐匹克隆分子结构中有非常强的荧光发射基团吡咯连吡嗪环，使得荧光检测的灵敏度比紫外线高，为了保证足够的灵敏度，通常采用荧光检测器[17，19，35-36]，激发波长 315nm，发射波长 380nm或 385 nm[19，35]，也有激发波长选择 307 nm，发射波长483 nm[17]。EI-SHAHENY等[36]使用荧光程序检测佐匹克隆及其代谢物，0～5.6min内激发波长305nm，发射波长370nm，5.6min后激发波长320nm，发射波长480nm。

近年来液相色谱-质谱联用法检测生物样品中的佐匹克隆报道增多[6，20-24]，该方法具有高灵敏度、高特异性的特点，最低检出限可达0.08ng/mL[23]，可同时检测生物样品中多种物质[21，23，38]，如佐匹克隆及其代谢物[6，22，24]，国内关于佐匹克隆代谢物的检测报道较少[6]。液相色谱-质谱联用法中，色谱柱常采用反相C18填料[20-21，23-24]，由于同时检测多种物质，多数采用梯度洗脱法[6，15，21]，流动相有甲酸铵（含 0.1%甲酸）-乙腈[21]、0.1%甲酸水和乙腈[6]、甲醇和0.2%甲酸（含5 mmol/L甲酸铵）水溶液[20]，pH=5.0醋酸铵缓冲液和0.05%的醋酸甲醇溶液[23]等，这些流动相中多数用甲酸调节pH值。TONON等[32]使用CHIRALPAK AD手性色谱柱分析脑组织中的佐匹克隆，最低定量限可达0.29ng/g，分析总时长小于5min。

3.3 其他方法

近年来还有人采用紫外分光光度法检测血液中佐匹克隆[7]，该方法先用盐酸酸化血清，目的是增加佐匹克隆在血清中的溶解度，再加10%的高氯酸甲醇溶液沉淀蛋白，血清中佐匹克隆在（310±1）nm处有最大吸收峰，比佐匹克隆标准品最大吸收峰（303±1）nm波长略有“红移”，可能是佐匹克隆可变异的助色基团溶解在10%高氯酸甲醇溶液中使吸收光谱的位置发生了变化，该方法在3.0～30.0 g/mL范围内线性关系良好，最低检出限为2.0g/mL。

早些年还有采用荧光分光光度法测定血中佐匹克隆的报道[8-9]，在血清样品中添加pH=6.86的磷酸盐缓冲液后再用 V（二氯甲烷）∶V（异戊醇）=98∶2 液液萃取，激发波长365 nm，发射波长520 nm，最低检出限0.03mg/L，荧光分光光度法测定佐匹克隆线性范围很宽，不同数量级的药物浓度其标准曲线斜率不同，当药物浓度超过500mg/L时产生荧光自熄灭现象。

此外，还有采用毛细管电泳-二极管阵列检测法测定佐匹克隆及其代谢物[33]和单扫描示波极谱法测定佐匹克隆[39]的报道。毛细管电泳法使用新毛细管时先用1mol/L氢氧化钠和去离子水先后各冲洗30min，每天使用前需用0.1mol/L氢氧化钠和去离子水各冲洗10min，活化好的毛细管进样前用0.1mol/L氢氧化钠和去离子水各冲洗1min。该分析中选用磷酸钠作为缓冲溶液，pH=2.5、浓度为50mol/L时峰形较好，迁移时间短，且峰面积和迁移时间重现性好。进样时间选择在8s，进样压力为1psi。单扫描示波极谱法是在0.1mol/L的盐酸溶液中，微量佐匹克隆可产生一个灵敏度较高的极谱还原波，根据佐匹克隆在一定浓度范围内与波峰有良好的线性关系，测定血清中佐匹克隆含量。研究[36]指出，血清中佐匹克隆经有机相提取后必须蒸干方能用pH=3的盐酸溶液溶解测定，否则测定结果偏低。

4 其他问题

需要指出的是，多篇文献[13，23，40-42]报道佐匹克隆在甲醇、乙醇等亲核溶剂中不稳定、易分解，因此在检验疑似佐匹克隆中毒的案件时，尽可能使用非亲核试剂（三氯甲烷、二氯甲烷和乙腈等）作为溶剂，以免发生分解而漏检。也有文献[42]指出佐匹克隆在pH大于9时不稳定。NILSSON等[24]研究了全血中佐匹克隆的稳定性，结果显示，血中的佐匹克隆在一定时间和温度的条件下会分解，在长期储存的血样中可能因为佐匹克隆分解而检测不到，佐匹克隆的最佳储存条件是-20℃短期储存，-20℃可以保存5～6个月，5℃可以储存1个星期，20℃可以保存2d，该研究还指出冻融对血中佐匹克隆没有影响。因此在推测血中佐匹克隆的真实浓度时应当考虑佐匹克隆的分解。NILSSON等[24]还研究利用佐匹克隆代谢产物2-氨基-5-氯吡啶来估算血中佐匹克隆的原始浓度。

佐匹克隆在人体内，主要通过3种途径在肝代谢，仅4%～5%以原型从尿中排出：11%经侧链氧化形成活性较弱的佐匹克隆N-氧化物；15%代谢成无活性的N-去甲基佐匹克隆均经肾排泄；50%酯键水解（包括氧化脱羧）产生无活性的代谢物，其中部分经肺以CO2形式排出。另外，佐匹克隆在动物尿液和胃组织中含量高，血液中佐匹克隆含量较低[8，12]。国内报道1例佐匹克隆中毒死亡案例[6]，死者尿液中佐匹克隆及代谢物的含量均高于血液中的浓度，而佐匹克隆N-氧化物和N-去甲基佐匹克隆也可作为佐匹克隆染毒的标记物。综上，尿液和胃组织是最理想的生物检材，浓度高于血液，因此，应当在最短的时间内取得当事人的尿液。

5 结 语

综上所述，采用气相色谱、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱、液相色谱-质谱联用、紫外分光光度等方法测定生物样品中佐匹克隆均具有较高的灵敏度、精密度和准确度。液相色谱-质谱联用法除具有高灵敏度、高特异性特点，还能对复杂混合物进行高效分离，定性的同时进行定量分析，是生物样品中佐匹克隆强有力的分析方法，具有很好的发展前景。随着分析技术的不断发展，生物检材中佐匹克隆的检测能力将不断增强。

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