1型糖尿病大鼠房室结HCN4表达的实验研究

张丽

【摘 要】目的：探讨4型超极化激活环核苷酸门控阳离子通道在1型糖尿病大鼠房室结中的表达。方法：腹腔注射链脲佐菌素溶液建立1型糖尿病大鼠模型，通过免疫荧光染色观察HCN4在房室结中的表达，免疫印记检测HCN4在房室结中蛋白水平表达变化。结果：HCN4在正常大鼠房室结细胞膜上可见有相对聚集的点状、条索状表达，1型糖尿病大鼠HCN4在细胞膜上表达减少，呈点状表达。Western blot显示糖尿病大鼠房室结HCN4蛋白质表达明显降低（P<0.05）。结论：正常大鼠房室结HCN4有表达，1型糖尿病大鼠房室结HCN4在蛋白质水平表达下降。

【关键词】1型糖尿病 HCN4 房室结

1型糖尿病（T1DM）患病率呈世界性上升趋势，绝大部分患者死于心血管系统疾病[1]。研究发现糖尿病患者在出现临床症状前已出现心室舒张功能障碍，原因是高血糖状态下心肌中K+流受抑制、Ca2+泵活性降低等电生理学异常导致心肌功能降低[2，3，4]。房室结是心传导系的重要组成，超级化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）是其自律性产生的重要基础，其中HCN4通道在房室结上有显著的表达，HCN4异常表达与房室结功能紊乱密切相关[5]。目前对于T1DM房室结中HCN4变化尚未见报道。本实验通过建立1型糖尿病大鼠动物模型，运用免疫荧光、Western-blot的方法，观察大鼠房室结HCN4表达变化，为认识、预防和治疗糖尿病相关的心肌病提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

成年健康雄性SD大鼠60只，体重（170±20）g（新乡医学院实验动物中心提供）。链脲佐菌素（美国Sigma公司）、兔多克隆抗HCN4通道蛋白抗体（以色列Alomone公司）、TR标记山羊抗兔IgG二抗（美国Santa cruz公司）、Anti-β-Actin及Goat Anti-Rabbit IgG/HRP二抗（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 1型糖尿病动物模型制作及实验分组

实验动物随机分为两组：对照组（20只）和实验组（40只）。两组大鼠普通饮食喂养1w后禁食12h，期间自由饮水，对照组大鼠腹腔一次性注射不含STZ的柠檬钠-柠檬酸缓冲液，实验组大鼠按剂量55mg/kg一次性腹腔注射STZ，3d后取尾静脉血测空腹血糖，血糖≥16.7mmol/L者为糖尿病大鼠。DM大鼠模型成功后，两组均持续喂养3m。

1.2.2 取材

水合氯醛腹腔麻醉后，开胸取房室结组织，一部分（对照组10只、实验组14只）液氮速冻，-80℃保存，用作冰冻切片；一部分（对照组10只、实验组15只）液氮速冻，-80℃保存，用于免疫印迹实验。

1.2.3 免疫荧光染色分析

Leica CM1850恒冷冰冻切片机中进行切片，厚度10um。一抗HCN4多克隆抗体（1： 50），二抗TR标记山羊抗兔IgG，荧光显微镜下观察荧光的分布。

1.2.4 免疫印迹反应（Western Blot）

取对照组和实验组房室结组织提取蛋白质，进行Western Blot分析。兔抗大鼠HCN4（1：400）、兔抗大鼠β-Actin抗体（1：500）作为一抗，辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，ECL显色。用凝胶成像分析仪采集图像并用Image J图像处理软件进行吸光度分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS14软件包进行统计学分析，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 免疫荧光染色

房室结纵切面上HCN4分布于细胞膜上，呈相对聚集的点状、条索状表达。1型糖尿病大鼠房室结HCN4在细胞膜上表达减少，呈点状表达（图1、2）。

2.2 免疫印迹反应（Western Blot）

12w时，对照组HCN4蛋白质有表达，实验组HCN4表达明显降低，与对照组相比有显著性差异（P=0.01，P<0.05） （表1、图3）。

3 讨论

持久的高血糖对心肌细胞的损害是糖尿病患者心肌病变产生的根本原因，其病理特征是心肌细胞肥大、心肌间质纤维化[6]。據文献报道，STZ诱导的糖尿病大鼠从糖尿病病程4w开始出现心肌的病理改变，心肌细胞凋亡显著增加且以心肌纤维的变性坏死为主。HCN4是正常起搏电流（If）产生的重要因素，对基础心率的维持起重要作用，并能随着机体的不同生理状态对频率进行调整。在各种病理因素的刺激下，心肌中HCN 通道表达异常或结构功能异常，导致 If增大或减小，最终导致各种心律失常。Zicha[7]等发现犬慢性心衰时窦房结的主要亚型HCN4表达下调而右心房HCN4的表达明显上调，并认为这可能是引起房性异位心律的主要原因。Yeh等[8]证实，在房性心动过速犬模型中，窦房结组织和心房组织中HCN表达也呈现了反向分化，这可能是快速房性心律失常伴有窦房结功能减退的发生机制。以上研究均提示心力衰竭患者病窦综合征和房颤发生率增多的机制可能与HCN4在传到系统即窦房结表达下调有关。本实验发现在病理情况下HCN4通道在房室结中表达降低，这与上述文献报道一致，表明HCN4通道的下降会引起心脏电生理活动的变化而产生心率失常，提示HCN4通道表达的变化可能在房室传导阻滞、室性心律失常的发展中有一定的作用。

参考文献：

[1]董砚虎.第18届国际糖尿病联盟大会概况[J].中华糖尿病杂志，2004，12（1）：67-69.

[2]Salem M，El Behery S，Adly A，et al.Early predictors of myocardial disease in children and adolescents with type 1 diabetes mellitus[J].Pediatr Diabetes， 2009， 10（8）：513-21.

[3]Gutierrez JC，Prater MR，Smith BJ，et al.Late-gestation ventricular myocardial reduction in fetuses of hyperglycemic CD1 mice is associated with increased apoptosis[J].Irth Defects Res B Dev Reprod Toxicol，2009，86（5）： 409-15.

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[5]Baruscotti M，Difrancesco D.Pacemaker channels[J].Ann N Y Aca Sci，2004，10（15）： 111-121.

[6]Liu J，Dobrzynski H，Yanni J，et al. Organisation of the mouse sinoatrial node： structure and expression of HCN channels[J].Cardiovasc Res，2007，73（4）：729-38.

[7]Zicha S，Fernández-Velasco M，Lonardo G，et al.Sinus node dysfunction and hyperpolarization activated （HCN） channel subunit remodeling in a canine hear-t failure model[J].Cardi ovasc Res，2005，66（3）：430-432.

[8]Yeh YH，Burstein B，Qi XY，et al.Funny current downregulation and sinus node dysfunction associated with atrial tachyarrhythmia[J].Circulation，2009，119： 1576-1585.