益肾通络方浓缩合剂的急性毒性实验※

马中华张宸铭孙自学祝莉孙赫宇

益肾通络方浓缩合剂的急性毒性实验※

马中华1张宸铭1孙自学2*祝莉1孙赫宇1

（1河南中医药大学硕士研究生2014级，郑州45008；2河南省中医院中西医结合生殖与男科诊疗中心，郑州45002)

目的通过观察小鼠灌胃给药后的中毒反应，考察益肾通络方浓缩合剂的安全性。方法将益肾通络方浓缩合剂以最大浓度(2.5 g/ml)和最大体积（0.4 ml/10 g）24 h内3次给药，连续观察14d内小鼠的活动情况和死亡数量，小鼠死亡0只，未测出LD50，测其最大耐受量。结果给药后14 d内小鼠生存状态良好，活动和饮食情况均无变化，部分小鼠有轻微腹泻，无死亡，空白组与给药组体重无统计学明显差异，血常规指标及生化指标也无明显差异，对两组小鼠的主要脏器进行病理组织学检查，两组小鼠的主要脏器经肉眼及镜检均无病理性差异。结论经实验测得小鼠灌胃给药的最大耐受量是300 g/kg，相当于临床成人日剂量的181倍。益肾通络方浓缩合剂有较高的安全性。

益肾通络方；急性毒性实验；最大耐受量

男性不育症不仅影响家庭和睦，甚至影响社会的稳定，引起了全社会人民的关注，研究表明，目前全世界受到不育困扰的夫妇约占已婚夫妇的15%[1]。引起男性不育症的病因病机复杂，还有相当一部分患者原因不明。目前现代医学对此类疾病尚无理想的治疗药物，为挖掘中医药在此领域的优势，诸多中医界的同仁进行了不懈的探索。益肾通络方由菟丝子、熟地黄、淫羊藿、丹参、水蛭、川牛膝、黄芪等药物组成，为导师孙自学教授多年临床经验处方，以补肾填精、活血化瘀为法组方，以之为基础化裁，临床应用治疗精索静脉曲张性不育症、特发性弱精子不育症，疗效显著。为了解本方浓缩合剂的临床安全性，我们进行了益肾通络方浓缩合剂的急性毒性试验。

1 材料与方法

1.1 药品菟丝子、熟地黄、淫羊藿、丹参、水蛭、川牛膝、黄芪，其饮片由亳州市先锋中药饮片有限公司提供，批号：160601，经河南省中医院中药制剂室煎制成浓缩合剂，每毫升约含生药2.5 g。

1.2 动物SPF级健康昆明小鼠，体重（20±2）g，雌雄各半。饲养于河南省中医院中心实验室，IVC系统，笼盒温度22～26℃换气20次/h，，湿度40%～60%，光照12h明暗交替，自由饮食，混合颗粒饲料（SPF级），江苏省协同医药生物工程有限责任公司生产，许可证号：苏饲证（2014）01008，执行标准：GB/T14924.3-2010。小鼠实验室适应性饲养3 d后开始实验。

2 方法[2]

2.1 预实验取小鼠10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水12 h，按空腹体重计算给药量，单次灌胃益肾通络方浓缩合剂(2.5 g/ml)0.4 ml/10 g，剂量为100 g生药/ kg，给药后全部皮毛光亮顺滑，行为活动、神经系统反应、自主神经系统反应正常，小鼠无死亡。因此单次给药无法测定其LD50，遂改为测定连续多次给药的LD50。经序贯法预实验，益肾通络方浓缩合剂24h内连续三次（7:00，12:00，17:00）灌胃给药小鼠死亡0只。给药后连续观察3 d。给药后3 d内部分小鼠有轻微腹泻，未见死亡小鼠。可供灌胃最大药量没有发生急性毒性反应，故不能测出LD50。

2.2 正式实验(最大给药量试验)小鼠40只，随机分为空白对照组和给药组，每组20只，雌雄各半。给药组每5 h给药1次，连续3次，空白对照组灌胃等量蒸馏水，方法同给药组。给药2 h后自由饮食，连续观察14 d。

2.2.1 观察与指标检测每日观察记录实验室情况，观察记录动物外貌特征、行为活动、粪便情况等，如有中毒反应的动物应取出单独饲养，重点观察。小鼠末次给药后观察14 d后摘取眼球取血行血液学检测及血清生化指标检测，血液学检测红细胞（RBC）、白细胞（WBC）及分类、血红蛋白（Hb）、血小板(Rt)、凝血酶原时间(PT)、网织红细胞计数(RC)，生化指标检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)。解剖后尸检，心肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等主要脏器有无异常变化，取心、肝、脾、肺、肾等脏器用10%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，做病理组织切片，光镜下进行病理学观察。

2.2.2 数据处理实验计量资料用均数土标准差（x±s）表示，数据用SPSS13.0统计软件协助处理。

3 结果

给药后14 d内小鼠生存良好，无异常活动，外观、精神状况、饮食情况均无变化，部分小鼠有轻微腹泻，未见死亡小鼠。小鼠灌胃最大给药量为300 g/（kg·d），相当于临床70 Kg的成人用药剂量的181倍，详见表1、表2。

表1 小鼠最大给药量结果

表2 剂量倍数转换表

给药组与空白对比，给药后第14 d体重无明显差异(P>0．05)，血常规指标及生化指标也无明显差异，对小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行力病理组织学检查，结果表明两组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等经光镜检验均无病理性改变，表明益肾通络方无明显的毒性作用。

4 讨论

益肾通络方主要由菟丝子、淫羊藿、熟地黄、丹参、川牛膝、黄芪、水蛭等十几味中药组成。方中菟丝子甘平入肾，可补肾填精，鼓动肾气，提高生精功能；淫羊藿甘温入肾，补肾助阳；二者共为君药；熟地黄甘、微温，质地柔润，温而不燥，入肝肾二经，有滋血补阴，生精益髓之效；丹参苦微寒，入血分而善活血通经，二者共为臣药；水蛭咸苦平，善于破血逐瘀通经，黄芪甘温，补益元气，升阳举陷，气旺则血行，瘀去络通，既可助丹参、水蛭通络活血又可防其破新血而不伤正，是为佐药；川牛膝性味苦平，活血通经，消肿止痛，可引药下行，直达病所，为佐使之剂。诸药合用，共奏补肾填精，活血化瘀通经之效。

菟丝子，味微辛，性平，入肝脾肾经，禀气中和，温而不燥，补阴而不腻滞。其入肾可补肾填精，入肝可养肝明目，入脾则益脾止泻，为平补肝肾之良药。具有补肾固精，鼓动肾气，提高生精功能之效。主治肝肾亏虚所致腰痛、遗精、阳痿、不育等症。淫羊藿，味甘、辛，性温，归肝、肾经，可壮肾阳，坚筋骨，补腰膝。凡肾阳虚所致痹痛，精冷不育，腰膝酸软，尿频失禁皆可用之。熟地黄，味甘，微温，归肝、肾经，质地柔润，温而不燥，故有滋阴养血，益髓生精之效，可治疗血虚诸证。丹参，味苦，微寒，归心包、肝经，凉血活血，入血分而善祛瘀止痛、活血行血。主治月经前后不定期，闭经痛经等。水蛭，咸、苦、平，归肝、肾经，功善破血逐瘀通经，用生水蛭治疗女性血瘀型不孕症，张锡纯建议研末冲服为佳。主要用于血滞经闭，跌打损伤等。黄芪，甘温，归脾、肺经。能补气升阳、益卫固表、利水消肿，治疗中气下陷引起的各种症状，同时还能托毒生肌，固表止汗。川牛膝，苦，平，归肝肾，活血通经，消肿止痛，本药性善下行，直达病所，是男科治疗常用的引经药。

现代药理研究认为：菟丝子可以保护机体的免疫器官而提高机体的免疫功能，并且有抗衰老的作用[3]。有实验研究显示其有直接促进精子活力和精子膜功能的作用[4]。淫羊藿可以促进核酸蛋白质合成，并具有雄性激素样作用；能促进性腺的发育，提高精子密度及精子活力[5]，淫羊藿水煎液灌胃可升高血浆睾丸酮的含量，增加睾丸和提肛肌的重量，并能有效地修复大鼠睾丸间质细胞的损伤，维持睾丸曲细精管上皮正常生精周期，对生殖内分泌系统可明显提高性功能，增加附属性器官重量，能增加性腺轴、肾上腺轴及胸腺轴功能。熟地黄对体液免疫和细胞免疫功能均有明显的增强作用，并且可以抗脂质过氧化[6]。另外，有研究学者认为肾藏精主生殖与矿物元素锌有关，锌是人体不可或缺的微量矿物元素之一，是维持性机能和性器官正常发育必不可少的物质[7]。有药理学研究还表明淫羊藿、菟丝子、熟地黄等补肾药物含有丰富的微量元素Zn、维生素E，丹参素具有清除自由基产生，减少脂质过氧化反应作用，丹参同时能抑制血小板聚集及血小板的激活，扩张微血管，改善微循环，促进血管新生[8]。水蛭别名蚂蟥，主要成分有水蛭素、组织胺、肝素，其可以阻止凝血酶对纤维蛋白的聚合，抑制血小板凝集，溶解血栓，降低血液黏稠度，抗细胞凋亡，抗炎，抗肿瘤，抗纤维化，改善肾功能等[9]。

成人(70 kg体重)益肾通络方水煎合剂临床生药日用量为116 g，小鼠灌胃最大给药量为300 g（kg·d-1），相当于临床成人用药剂量的181倍，一般认为，按体重计算，最大给药量相当于临床成人日用剂量的100倍以上则较为安全[10]，本实验过程中动物不出现死亡，测不出LD50，表明益肾通络方水煎合剂口服用药短期内无毒、安全可靠。

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Acute Toxicology Experimental Study on Yishen Tongluo Concentrated Decoction

MA Zhonghua1,ZHANG Chenming1,SUN Zixue2,ZHU Li1,SUN Haoyu1
(1.Grade 2014 Graduate,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 45008,China; 2.Diagnosis and Treatment Center of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine and Andrology,Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 45002,China)

Objective We study on the security of Yishen Tongluo concentrated decoction though observing mice's toxic reaction during 14d after given Yishen Tongluo decoction intragastically.Methods The mice were given high dosage(2.5g/ml)and the most volume (0.4ml/10g),and were affused three times during 24h.Then mice's action and the number of deaths were recorded.There was no death. LD 50 could not be determined.We had no other choice to measure the maximal tolerance dose.Results Mice's in good conditions during 14d after administrating,the appetite and activity had no change,and there was no death.The weight,blood count and blood biochemical parameter had no distinct difference.The macroscopic observation and microscopic observation of two sets mice main viscera had no histopathological difference.Conclusion This experiment showed that maximal tolerance dose administration to mice was 300g/kg/d,about 181 times equal to the adult clinical daily dose.Yishen Tongluo concentrated decoction has higher security.

Yishen Tongluo decoction;acute toxicology experiment;maximal tolerance dose

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.07.062

1672-2779（2017）-07-0135-03

：李海燕本文校对：郝高利

2016-12-27）

国家自然科学基金【No：81573981】；国家自然科学基金【No：81603632】

*通讯作者：sunhhzx@163.com