禽流感血凝和血凝抑制试验的影响因素分析

郭新钢

(乌鲁木齐经济技术开发区(头屯河区)畜牧兽医站,新疆乌鲁木齐830023)

禽流感血凝和血凝抑制试验的影响因素分析

郭新钢

(乌鲁木齐经济技术开发区(头屯河区)畜牧兽医站,新疆乌鲁木齐830023)

在进行禽流感血凝和血凝抑制试验时,要严格按照操作规程,考虑多方面的因素,尤其要注意各步骤操作的细节,认真细致地进行操作,尽量消除不利影响,减少误差,确保试验结果的准确性。

禽流感血凝;血凝抑制;试验

影响禽流感血凝和血凝抑制试验结果的因素很多，因此，试验过程中一定要注意质量控制，统一试验标准，规范操作程序，这样才能获得准确、有效的试验数据，才能科学评价免疫效果，为禽流感防控提供有力的技术支撑。

1 血清的处理及保存

1.1 溶血

造成溶血的因素有很多，像注射器或容器不干燥、不清洁；穿刺不顺利，组织损伤过多；淤血时间过长；抽血速度太快；血液注入容器时未取下针头或注入速度过快产生大量泡沫；振荡过于剧烈等，在实际操作中都应该注意。笔者采用一次性注射器进行采血，然后带回实验室让血清在注射器中自然析出，很好地避免了溶血的出现。

1.2 分离血清

采集的血样应倾斜放置于室温或37℃恒温箱内（冬天常采用该方法），一般1～2h可析出血清。如果条件不允许，则应尽快送实验室进行离心。

1.3 胶冻样血清

笔者在多次采集血样时，有时会遇到少数胶冻样血清，可能与血液中脂类含量过高有关。处理办法是用一根洁净的玻璃或塑料棒将胶冻样的血清挑起，在管壁上挤压几下，用适当的转速和时间离心，即得到供抗体检测的血清样。

1.4 血清的保存

在5d内测定的血清样品可放置于4℃的冰箱中冷藏。样品待检时间超过1周的，需低温冰冻保存。保存的血清样品一定要作好标记和封闭。有时冷冻保存的血清样品需要多次检测，血清需要反复冻融，这时要注意，检测结果已不准确。笔者选择免疫抗体水平较高的30份血清，平均分成A、B、C3组，A组被检血清反复冻融，B组检测抗原反复冻融，C组为对照组。3个试验组同时做血凝抑制试验，得到的结果是：A组抗体水平比对照组低1个滴度，B组抗体水平比对照组低2个滴度。可见样品反复冻融对结果有影响。建议样品反复冻融不应超过5次，对于确实需要多次分批检测的，可将血清样品分装。

2 器材选用

2.1 微量血凝板

微量血凝板使用一次性塑料反应板能够避免清洗和磨损问题。

2.2 微量移液器

微量移液器有多道和单道2种，使用前或使用一段时间后应进行校正或鉴定，使用时一定要掌握正确的操作方法，吸头要安装牢固，防止漏气和掉落，手按压时下的力度要均匀，吸取液体时一定要缓慢平稳地松开，还要注意细节问题，如预先吸取样品溶液，然后再正式移液；吸头管嘴浸入液面的深度不要过深等，从而尽可能地减少误差。

2.3 移液器枪头

移液器枪头要选择质量好的，枪头光滑笔直，不易在管壁上挂液，在用多道微量移液器时一定要注意安装上枪头管嘴能够并齐。

3 试验操作

3.1 缓冲液

试验使用的稀释液最好为0.01mol/LpH值为7.0～7.2的等渗磷酸缓冲液（PBS），尽可能现配现用，如果用生理盐水代替缓冲液有可能会产生误差，因为生理盐水不具备缓冲功能。针对稀释液对禽流感血凝及血凝抑制试验的影响进行了试验研究。结果显示，用pH值为7.0的PBS缓冲液测定抗原的血凝滴度比常用生理盐水和调pH值至7.0的生理盐水高出将近一倍，测定的阳性血清的抗体滴度高出一个孔。

3.2 1%红细胞悬液

配制红细胞悬液应采集3只或以上成年健康SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的公鸡，在洗涤红细胞时要去除表面的白细胞膜，否则将影响红细胞的敏感性。最好用与试验血清来源相同的禽种红细胞，以避免易产生非特异现象。

3.3 4个血凝单位抗原

抗原必须在有效期内使用。先对抗原做血凝试验，以抗原与红细胞完全凝集的孔作为抗原效价，再根据抗原效价，配成4个血凝单位（HAU）抗原，4个HAU抗原要现用现配，室温下放置不要超过4h，不可反复冻融。防止4个HAU抗原配制不准确。抗原也需要分多次使用，为避免抗原反复冻融，对实验结果产生影响，可根据实验样品量将抗原分装。

3.4 加样

在试验中需要加PBS、待检血清、4个血凝单位抗原、1%红细胞悬液。加样时须注意以下几点：抗原和红细胞使用前一定要回归室温并充分混匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致；注意吸头勿碰触到U型或V型板孔，以免发生交叉污染；加样时应将所加物加在U型或V型板的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出；倍比稀释血清时，移液器吸头不要离开液面，防止产生气泡，造成移液量不准。

3.5 孵育

凝集板在孵育静置过程中，一定要耐心等待，不要在凝集过程中振动凝集板。孵育温度对试验的影响较大，从4～37℃，随着温度的上升，HA与HI的滴度也跟着升高。同时，温度的高低也影响到反应的速度，温度过低反应速度减慢，温度过高会使反应结果洗脱加快，所以孵育温度常控制在24℃为最佳。此外，孵育时间也须严格控制，一般来说，以红细胞对照完全沉淀的前后5min内判定试验结果较好，大约在30～40min左右。

4 结果判定

在环境温度24℃，经过15～30min即可读出抗原效价和血清抗体滴度。当温度过低，出现结果要慢；环境温度过高，超过30℃时，试验结果出现得要快，一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象。判读试验结果时，将微量反应板倾斜45°，孔底沉淀的红细胞流动呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒者为凝集完全抑制。

5 小结

在进行禽流感血凝和血凝抑制试验时，一定要注意并避免以上问题，充分考虑到各方面的影响因素，才能得出准确可靠地实验数据，准确掌握禽类的免疫抗体水平，使监测工作更具有指导性的意义，做到早发现早预防早治疗，进而为科学防控禽流感提供理论依据。

[1] 徐运芳.浅谈影响禽流感血凝抑制试验的因素[J].中国兽医杂志，2011，47（3）：84-85.