中温酱牛肉中腐败菌的分离鉴定与防腐剂对其抑制作用

潘晓倩，张顺亮，李素，赵婉婧，乔晓玲，陈文华，李家鹏，曲超，赵燕*

中温酱牛肉中腐败菌的分离鉴定与防腐剂对其抑制作用

潘晓倩1，张顺亮1，李素1，赵婉婧2，乔晓玲1，陈文华1，李家鹏1，曲超1，赵燕1*

（1.中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京100068；2.北京农学院食品科学与工程学院，北京102206）

将真空包装中温酱牛肉置于25℃条件下贮藏，对其中的腐败细菌进行分离和鉴定，并通过管碟法分析肉制品中常用的7种防腐剂对这些菌株的抑菌作用。结果表明，从细菌总数平板上共分离出9株菌落形态不同的微生物菌株，根据形态学、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，发现其由5株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、3株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和1株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）组成。乳酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯、双乙酸钠和乳酸链球菌素（Nisin）对9株腐败菌普遍具有较明显的抑菌活性，而山梨酸钾、亚硝酸钠和脱氢乙酸钠抑菌效果相对较差。

中温杀菌；酱牛肉；腐败菌；分离鉴定；防腐剂

酱卤肉制品是深受我国消费者欢迎的一种中式传统肉制品，历史悠久，其中酱牛肉因其营养丰富、风味独特而备受推崇[1]。但传统酱牛肉多属于低温肉制品范畴，存在货架期短、不便于长途运输及常温贮藏等缺点[2]。如采用高温高压杀菌（121℃热加工）能够达到商业无菌，货架期延长，但风味[3-4]、口感[5]、营养[6]等均受到不同程度的损害。中温肉制品是近年来一种新兴的肉制品产品形式，指经过温度90～110℃条件下杀菌，并联合其他抑菌保鲜和品质保持技术生产的产品[7]。与其他两种杀菌方式相比，中温杀菌能够有效降低产品的初始菌数，达到常温流通及贮存的目的，又很大程度地避免了肉制品风味、口感和营养品质被破坏，更能满足消费者对高品质肉制品的需求。然而，中温杀菌虽然能够杀灭绝大部分细菌营养体细胞，但会残留一些芽孢菌等少数耐热微生物[8]，在室温25℃贮藏条件下，这些未完全被杀灭的微生物经过短暂的修复、适应后将重新生长繁殖，最终引发产品的腐败变质[9]。

引起肉制品腐败变质的微生物构成十分复杂[10]，国内外研究多集中于低温熟肉制品的优势腐败菌方面[11-12]。研究发现，乳酸菌是引起真空包装低温熟肉制品腐败的主要微生物，包括乳杆菌属、明串珠菌属和魏丝菌属[13-14]，其次是假单胞菌、芽孢杆菌、热死环丝菌和肠杆菌等[15-16]。刘勤华等[1]研究发现，真空包装酱牛肉中腐败细菌包括乳酸菌、假单胞菌属和芽孢杆菌属等；孙承锋等[17]则发现，巴氏杀菌酱牛肉中乳酸菌是优势菌，其余为葡萄球菌和芽孢杆菌，肠杆菌、假单胞菌和热死环丝菌几乎不存在；非真空包装酱牛肉低温贮存时的主要腐败细菌包括葡萄球菌属、肠杆菌科及热死环丝菌，假单胞菌所占比例很小[2]。熟肉制品腐败微生物的菌相构成，取决于产品初始菌群污染的种类和数量，肉制品组分和杀菌工艺条件等[18-19]。此外，同种产品在不同包装方式和贮藏流通条件下，腐败菌菌相构成也会发生变化[20-22]。

本实验以中温杀菌酱牛肉为研究对象，按照国标规定测定其贮藏期间菌落总数变化，并从腐败样品中分离、培养微生物菌株，通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析进行鉴定并绘制生长曲线。同时测定乳酸链球菌素（Nisin）等7种肉制品中常用防腐剂对分离得到的腐败菌株的抑制效果，旨在为中温酱牛肉腐败微生物的有效控制提供依据，也为其他中温酱卤类肉制品的防腐保鲜和货架期的延长提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛后腿肉：五丰福成食品有限公司；食盐、白砂糖、香辛料等：中国肉类食品综合研究中心香辛料部；葱、姜：市售；高温蒸煮袋：北京万华铝塑包装有限公司。

平板计数琼脂（platecountagar，PCA）培养基、营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基：北京陆桥技术有限责任公司。

Nisin、亚硝酸钠、乳酸钠（食品级）：北京迪朗生化科技有限公司；山梨酸钾、脱氢乙酸钠（食品级）：南通奥凯生物技术开发有限公司；葡萄糖酸-δ-内酯（食品级）：安徽省兴宙医药食品有限公司；双乙酸钠（食品级）：连云港信仁食品添加剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCRMasterMix：天根生化科技有限公司；DNA Marker、溶菌酶：宝生物工程（大连）有限公司；通用引物27F（5′-AGA GTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTA CCTTGTTACGACTT-3′）：由上海立菲生物技术有限公司（北京）合成。

1.2 仪器与设备

700-1000型杀菌釜：山东诸城中泰机械有限公司；BSA822-CW型电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；F1-45型恒温培养箱、G154DWS湿热灭菌锅：日本三洋公司；BSC-1000二级生物安全柜：新加坡Esco公司；SCIENTZ-11L型无菌均质器：浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪、Gel DocTMXR+凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司；蔡司ZEISS primo star生物显微镜：北京普瑞赛司仪器有限公司；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪及配套芽孢杆菌鉴定卡（BCL卡片）：北京威泰科生物技术有限公司；Bioscreen全自动生长曲线分析仪：上海谓载商贸发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中温酱牛肉加工工艺流程

原料肉→解冻→分割修整→滚揉腌制→焯水→煮制→冷却→真空包装→中温杀菌（100℃、20 min）→成品（约200 g/包）

1.3.2 腐败菌的分离与纯化

真空包装中温酱牛肉成品于室温（25℃）贮藏，每隔2 d取样测定产品菌落总数，每个取样点设3个平行。贮藏过程中测定产品菌落总数：无菌条件下随机从酱牛肉不同部位取样25 g，剪碎，放入无菌均质袋中，再加入225 mL无菌生理盐水，用无菌均质器拍打均质，梯度稀释后，采用PCA培养基对中温酱牛肉贮藏过程中的细菌总数进行平板计数，每个实验设3个重复。当菌落总数超过国家标准GB 2726—2005《熟肉制品卫生标准》[23]规定的8×104CFU/g时，停止计数。从贮藏过程中PCA平板上挑取典型生长的菌落并反复划线纯化，获得单菌株并进行菌种保藏[24]。

1.3.3 腐败菌的菌种鉴定

（1）形态学观察和革兰氏染色

将已纯化的菌株接种至PCA培养基，37℃培养18～24 h后观察其菌落形状、色泽、隆起度等特征，革兰氏染色并镜检观察菌体形态。挑取、转接单菌落于PCA平板上，37℃培养48 h，进一步利用相差显微镜观察菌株是否产生芽孢。

（2）生理生化鉴定

用无菌棉签蘸取平板上纯菌落，制备1.8～2.2麦氏单位浓度的菌悬液，用全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

（3）分子生物学鉴定

采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量和片段大小。采用通用引物27F和1492R，以基因组DNA为模板扩增16SrRNA序列。聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）反应体系（50 μL）：DNA模板2 μL，引物27F和1492R各1μL，2×TaqPCRMasterMix25μL，重蒸水21μL；PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经凝胶电泳分析后，送至英潍捷基（北京）贸易有限公司测序，应用BLAST程序将测序结果在GenBank基因数据库中进行同源性比较以鉴定菌种归属。

（4）防腐剂对主要腐败菌的抑制实验

防腐剂配制：称取相应质量的7种防腐剂（精确到0.001 g），加无菌生理盐水充分溶解，再用0.45 μm无菌滤膜过滤除菌。所配制的7种防腐剂的质量浓度参考国家标准GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[25]中规定的各自在酱牛肉中的最大添加量及实际生产使用情况，防腐剂名称和具体添加量见表1。

表1 7种防腐剂质量浓度Table 1 Concentration of seven preservatives

管碟法[26]：将所筛选的腐败菌菌株接种至营养肉汤中，摇床培养18～24 h，得到浓度为108～109CFU/mL的菌悬液，灭菌后的PCA培养基冷却至45℃左右，在每100 mL上述培养基中添加2 mL活化好的菌悬液，充分混合均匀后倒入平板。待凝固后，以无菌操作在培养基表面垂直、均匀地放置牛津杯（直径8.00 mm），取200 μL防腐剂溶液分别加入牛津杯中，以无菌生理盐水为对照，37℃培养24 h后，移去牛津杯观察并测量抑菌圈直径d（mm）。每组3个平行，取平均值，抑菌圈大小X（mm）计算公式为：X=d-8.00

2 结果与分析

2.1 腐败细菌的分离与形态学特征

依据国家标准GB 2726—2005《熟肉制品卫生标准》[23]规定，酱卤类肉制品销售前的菌落总数需≤8×104CFU/g，真空包装中温酱牛肉在25℃贮藏37 d时，菌落总数超过国家标准。在此过程中，从PCA培养基上共分离挑取特征菌落9个，编号依次为N100-1～N100-9。革兰氏染色镜检后发现这9株菌均为革兰氏阳性杆菌且生长过程中产生芽孢。各菌株的菌落形态观察结果见表2。

表2 9株腐败菌菌落特征Table 2 Colony characteristics of nine spoilage bacteria strains

2.2 腐败细菌的生理生化鉴定

根据9株腐败细菌的形态学观察结果，选取BCL鉴定卡，利用全自动微生物鉴定仪进行生理生化鉴定，结果见表3。由表3可知，菌株N100-1、N100-3和N100-9初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens），菌株N100-4为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），其余5株菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）。根据VITEK 2 Compact产品信息说明，由于枯草芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌生化谱基本一致，且解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌属于相似菌群，因此需要利用分子生物学手段进一步区分及验证。

表3 9株腐败菌的生理生化鉴定结果Table 3 Identification results of nine spoilage bacteria strains by physiological and biochemical experiments

续表

2.3 分子生物学鉴定与系统发育树构建

经测序，9株细菌的16SrRNA基因序列大小约为1500bp，均符合细菌16S rRNA序列长度。将各菌株序列在NCBI网站上进行比对，利用MEGA5.0软件分析其与芽孢杆菌属内相关种的同源性，一般认为，同源性＞99%则属于同一种[27]。同时，绘制系统发育树，明确9株细菌之间及与相关芽孢杆菌种之间的亲缘关系，结果见图1。

图1 基于16S rRNA基因序列同源性的9株腐败菌系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of nine spoilage bacteria strains based on homology of 16S rRNA gene sequence

经生理生化鉴定和分子生物学分析可知，菌株N100-2、N100-5、N100-6、N100-7、N100-8鉴定为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）；菌株N100-1、N100-3、N100-9鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）；菌株N100-4鉴定为蜡样芽孢杆菌（B.cereus）。

从真空包装中温酱牛肉25℃贮藏过程中分离的9株腐败菌均属于芽孢杆菌属，这主要与杀菌工艺与贮藏温度有关。低温肉制品中一些腐败菌如肠杆菌、假单胞菌和热死环丝菌耐热性差，可能在100℃的二次杀菌过程中被杀灭，且室温贮存有利于芽孢杆菌的迅速增殖[17]。

2.4 管碟法检测防腐剂对9株腐败菌的抑制作用

由表4可知，7种防腐剂对9株腐败菌的抑制效果有所差异，其中乳酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯、双乙酸钠和Nisin这4种防腐剂对9株腐败菌具有普遍较好的抑制效果。而山梨酸钾除对菌株N100-4具有一定抑制作用外，对其余8株腐败菌抑制作用极弱或未表现出抑菌效果。亚硝酸钠对菌株N100-5没有抑菌作用，对另外8株腐败菌只有微弱的抑菌效果。脱氢乙酸钠对菌株N100-2和N100-4表现出良好的抑制效果，但对其他菌株抑制作用微弱。比较发现，同种防腐剂对不同种属的细菌抑菌效果不同，而且对同种细菌的不同菌株之间抑菌效果也存在一定差异。

表4 管碟法测定7种防腐剂对9株腐败菌的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of seven preservatives on nine spoilage bacteria strains by cylinder-plate method

葡萄糖酸-δ-内酯属于新型多功能的食品添加剂，其抑菌机理主要表现在溶于水后分解释放出一种酸性物质—葡萄糖酸[28]，实验发现其对中温酱牛肉中分离出的9株腐败菌均表现出良好的抑菌活性，可见将其应用于中温肉制品防腐保鲜领域具有广阔的前景。Nisin是一种应用非常广泛的生物防腐剂，具有使用剂量低，抑菌效果好的特点[29]，实验中，Nisin对9株芽孢杆菌具有较明显的抑菌效果，这与文献[26]中报道的结果一致。山梨酸钾主要对霉菌、酵母等发挥抑制作用，具有一定的局限性，适宜与其他防腐剂复配使用[29]。

3 结论

本研究从真空包装中温酱牛肉常温（25℃）贮藏过程中分离得到9株特异性菌株，通过形态学观察、生理生化分析和分子生物学鉴定，确定其由5株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、3株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和1株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）组成。管碟法抑菌实验表明，乳酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯、双乙酸钠和Nisin这4种防腐剂对9株腐败菌具有普遍较好的抑制效果，而山梨酸钾、亚硝酸钠和脱氢乙酸钠抑菌效果相对较差，且具有一定局限性。

微生物生长繁殖是影响中温肉制品货架期的决定性因素，本研究从真空包装酱牛肉中分离到的微生物菌株会导致产品菌落总数超标，但有关这些微生物菌株的致腐能力、中温酱牛肉腐败菌的组成和腐败过程中产品感官和食用品质变化等研究还有待进一步开展。针对中温酱牛肉中芽孢杆菌为主要腐败菌的特点，开展芽孢快速诱导萌发杀灭技术研究，将进一步为中温肉制品的防腐保鲜提供有价值的指导。

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Isolation and identification of spoilage bacteria from sauced beef sterilized at medium-temperature and effect of preservatives on inhibition of the bacteria

PANXiaoqian1,ZHANGShunliang1,LISu1,ZHAOWanjing2,QIAOXiaoling1,CHENWenhua1,LIJiapeng1,QUChao1,ZHAOYan1*
(1.Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology,China Meat Research Center,Beijing 100068,China; 2.College of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

Spoilage bacteria were isolated and identified from vacuum-packaged sauced beef sterilized at medium-temperature and stored at 25℃.The bacteriostatic efficacy of seven common preservatives in meat products on these strains was analyzed by cylinder-plate method.Results indicated that nine strains with different colonial morphology were isolated from the plates,and identified as fiveBacillus subtilisstrains,threeBacillus amyloliquefaciensstrains and oneBacillus cereusstrain by morphological observation,physiological and biochemical tests and 16S rRNA gene sequence.Sodium lactate,glucono-δ-lactone,sodium diacetate and Nisin generally had obvious bacteriostatic activity on these nine spoilage bacteria strains,but the bacteriostatic effect of potassium sorbate,sodium nitrite and sodium dehydroacetate was relatively poor.

medium-temperature sterilization;sauced beef;spoilage bacteria;isolation and identification;preservative

TS251.1

0254-5071（2017）03-0024-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.006

2016-12-01

“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD28B01）

潘晓倩（1987-），女，工程师，硕士，研究方向为畜产品加工与肉制品质量安全。

*通讯作者：赵燕（1973-），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品加工质量安全控制和清洁生产与节能减排。