食物中食源性病原菌检测技术研究进展

周威，胡梁斌，李红波，张浩，莫海珍

（河南科技学院食品学院，河南新乡453003）

食物中食源性病原菌检测技术研究进展

周威，胡梁斌，李红波，张浩，莫海珍

（河南科技学院食品学院，河南新乡453003）

食源性病原菌的检测技术对维持我国的食品安全至关重要，目前所使用的检测技术主要包括传统的培养鉴定方法和以免疫学和分子生物学为主的快速检测方法。对以上方法的技术特点和应用情况进行综述，同时对食源性病原菌检测技术发展面临的困难和研究方法进行分析。

食源性病原菌；检测技术；免疫学；分子生物学

随着食品产业的快速发展和消费者的消费习惯的改变，对于食品卫生和食品安全的要求越来越高。而受到环境、气候等影响，食源性病原菌污染食品造成疾病的几率越来越高。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指出食源性病原菌是主要的食品安全风险隐患，可造成食源性疾病和食物中毒爆发[1]。统计数据表明，全世界每年发生的食源性腹泻病例超过2亿次，其中65%以上的病例食用过被食源性病原菌污染的食品[2]。国内的研究资料显示，在发生的食源性疾病中，由于污染病原菌导致疾病发生的比例达到71.28%[3]。由此可知，食源性病原菌污染导致的疾病，广泛存在于发达国家和发展中国家。从概念上讲，食源性疾病是指生物性病原体等有毒有害物质通过食用方式进入人体并引起的疾病，包括中毒性和感染性发作，包括最为常见的化学性有毒有害物质中毒、人畜共患传染病和肠道传染病等[4]。目前，最常见的食源性病原微生物主要包括黄曲霉菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌等[5]。本文对食品中食源性病原菌的检测技术发展现状进行综述，为我国食品中病原菌的检测、监督和控制提供借鉴。

1 食源性病原菌传统检测技术应用情况

病原菌的传统鉴定方法主要是指先培养后观察的方法，具有较高的鉴定效率，但存在培养时间过长的缺点。目前主要的传统鉴定方法，主要包括以下几类。

1.1 培养鉴定法

培养鉴定方法基于生物化学的原理，对不同病原菌在生长代谢过程中产生的酶类进行特异性鉴定，检测的酶类包括磷酸酶、蛋白酶、DNA酶、脂酶、酯酶和糖苷酶。具体的操作方法是：在特定培养基中加入指示剂和反应底物，保证细菌在培养基上的生长过程中产生一定颜色或发出荧光，实验人员通过观察菌落颜色、数量和形态进行鉴定。这种方法具有直观性的特点，要求检查条件不高，非常适合基层地区开展，也是当前微生物检测技术的主要方法[6]。

1.2 载体培养法

在培养鉴定法的基础上，发展处载体培养法鉴定方法。载体培养费又称干片法，其原理是采用安全无毒的高分子材料为载体，分别将显色物质和培养基附着其上，之后通过培养，对病原菌的显色反应和生长特征进行鉴定。这种方法操作简单并且直观准确，可以将食物采样和细菌接种同时进行，并保留培养鉴定法的优点，基本符合定量检测的需求。特别是在乳品检测中，载体培养法的升级版本-滤膜法已经广泛应用于奶油、巴氏杀菌乳和生乳的食品生产中[6]。

2 快速检测技术应用情况

快速检测技术是在传统的鉴定方法基础上开发出来的，具有节省时间、操作简便和准确率较高的优点，主要包括以下几种。

2.1 自动化微生物快速培养与鉴定系统

自动化微生物快速培养与鉴定系统是在传统的鉴定培养方法基础上，使用计算机和仪器组合完成病原菌检测的自动化和集成化，在专业分析软件的帮助下，达到灵敏、准确、快速和简便的目的。该系统主要由病原菌培养系统和病原菌鉴定系统组成，培养系统可以在较短的时间内，完成增菌实验；鉴定系统通过计算机形态学和生化分析软件对病原菌的形态和代谢特征进行分析，最终达到鉴定的目的。目前，自动化微生物快速培养与鉴定系统已经广泛应用于多种食品安全检测机构，检测结果认可较高[7]。

2.2 免疫学检测方法

免疫学检测方法主要根据抗原抗体的特异性反应对病原菌进行鉴定，这类方法的发展前提是获得特异性的病原菌抗体，根据检测手段的不同，目前主要包括：酶联免疫分析法、免疫磁珠分离技术、双功能抗体检测技术和胶体金检测技术。

2.2.1 酶联免疫分析法

酶联免疫检测技术（ELISA）是目前发展较为成熟的免疫学检测方法，只需要获得特异性的抗原抗体就可以设计研发。对于食源性病原菌的检测通过采用双抗夹心ELISA的方法，可以提高检测的特异性和准确性。国内外多个公司开发出大量的ELISA检测试剂盒，可以检测小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、乙型溶血链球菌、空肠弯曲杆菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7等多种食源性病原菌[6]。

2.2.2 免疫磁珠分离技术

免疫磁珠分离技术是一种基于免疫学原理的以抗原抗体特异性反应为基础的分离鉴定技术，目前已经广泛应用于病原菌的富集与分离。其基本原理是将病原菌特异性抗体制备成超顺反子磁性颗粒，将这种颗粒混合在食品样本中，可以与病原菌发生特异性结合，然后通过磁场作用实现病原菌的分离与富集。免疫磁珠分离技术由于具有富集和分离双重属性，因此其兼容性非常好，可以与流式细胞仪、电化学技术、免疫学技术、分子生物学技术和形态学鉴定技术有限结合，真正实现食源性病原菌的的快速检测。以此为基础开展的快速检测已经应用到实际监管中，如免疫磁珠分离技术和PCR技术联用组建的食源性病原菌快速检测设备已经应用于实际监管中[8]。但是由于食品样本成分复杂，基质组成较多，导致免疫磁珠分离技术在应用上受到限制，因此在未来的发展中，制备免疫磁珠富集体系环境、选择适合的增菌培养基和制备高性能的免疫磁珠是将来主要的发展方向。

2.2.3 双功能抗体检测技术

免疫学检测技术主要依靠于抗体的特异性，开发一种新型抗体同时识别两个不同的抗原，必然可以提高检测的效率。在这种设想下，双功能抗体检测技术在2014年被应用于单核细胞增生李斯特菌的检测，该方法不需要进行培养，并且检测灵敏度可以达到102cfu/mL～103cfu/mL[9]。以可以检测李斯特菌的双功能抗体为例，简单介绍其设计原理，研究者首先需要分别制备识别单核增生李斯特菌和红细胞的特异性抗体，之后进行均匀混合，利用氧化作用，是两种抗体间形成可连接的二硫键，然后再通过还原反应提高混合抗体的二硫键组合效率，最终得到一种同时可以识别单核细胞增生李斯特菌和红细胞的双功能抗体。这种双功能抗体在应用过程中与普通抗体一样，可以直接加入待测样本中，20 min～30 min后既可以引起血红细胞发生聚集，形成经典的血凝现象，可直接食用肉眼观察[9]。然而这种方法在使用上仍然存在诸多限制，而且在制备上效率仍然过低，但是由于这种方法不需要特定的检测仪器，使用上具有灵活准确的优点，仍有值得我们期待。

2.2.4 胶体金检测技术

胶体金检测技术是在ELISA检测技术之后，已经成型的一种免疫学快速检测技术，这种技术根据抗原抗体翻译，采用层析膜为反应载体、胶体金为显示信号，以检测卡或检测试纸条的形式保存。由于胶体金试纸条可以10 min获得检测结果，因此已经成为主要的食品安全现场快速检测方法。目前商品化的胶体金试纸条可以检测结肠弯曲杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、蜡样芽孢杆菌、军团菌等多种食源性病原菌[10]。

2.3 分子生物学检测方法

分子生物学检测方法是目前生物医学领域检测病原体主要的快速检测手段，目前应用于食源性病原菌的检测方法包括：PCR检测技术，环介导等温技术，基因探针技术和生物芯片技术。

2.3.1 PCR检测方法

聚合酶链式反应简称为PCR，是最常用的分子生物学检测手段，其与免疫学方法的特异性不同，PCR检测的是食源性病原的特定基因片段。在实际工作中，PCR技术可以在2 h内完成食源性病原菌的检测，并且不需要进行前期的增菌培养。但是在反应体系中存在腐殖质、金属离子、高脂肪或高蛋白是，将会抑制PCR检测的效率，因此常规检测中，仍然需要通过增菌实验（小于3 h），提供检测的灵敏性。

2.3.2 环介导等温技术

环介导等温技术（LAMP）是由日本荣研株式会社研发的一种基因扩增技术。它依赖于一种特殊的DNA聚合酶，可以识别靶基因上的6个特定区域并进行扩增，因此LAMP技术具有恒温扩增和特异性高的特点。通过加热荧光染料（Eva Green、GelRed、溴化乙锭和SYBER Green），仅需在紫外灯下就能进行结果观察，不需要任何仪器。从2008年开始，研究者开始使用LAMP方法对食源性病原菌进行检测，建立了高于PCR方法20倍灵敏度的检测方法。在2013年，我国研究者通过大规模的筛选工作，建立一种多重LAMP检测技术，可以同时实现单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的同时检测。LAMP检测技术要求设备简单，操作简单，非常适合我国国情，可以广泛应用在基层研究中，出于这一目的我国已经建立多项LAMP技术的检测标准[9]。根据国家的标准，目前已经有基于LAMP检测技术的实验设备上市，可以对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等多种病原菌进行检测。

2.3.3 基因探针技术

基因探针是一段被特殊标记的小段核酸，根据碱基互补原则，基因探针可以与目的基因发展特异性杂交，由于其被特殊标记过，因此可以实现检测目的基因的目的。对于基因探针的标记方式发展快速，经标记过的探针表现出安全、准确和直观的特点。在实际工作中，基因探针对于食源性病原菌的rRNA序列特异性识别，并进行高复制量扩增，因此可以保持较高的灵敏度。

2.3.4 生物芯片技术

生物芯片技术是基于基因探针技术发展而来的快速检测方法，其原理是将特异性的基因探针固定在芯片上，对原始或富集后的样本进行杂交，最后通过信号接收的方式对检测结果进行判断。从原理上讲，生物芯片技术具有基因探针和PCR技术的优点，但是在操作性和高通量上又优于这两种方法，因此一直是我国食品行业标准研究的热点，如肉及肉制品中常见致病微生物检测方法-生物芯片法（SN/T 2651-2010《肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法》）、食源性致病菌基因芯片鉴定方法（SN/T 1543-2005《食源性致病菌基因芯片鉴定方法》）很早被引入行业标准中[10]。目前适用于检测的生物芯片共包括两类，一种是基因芯片，另一种是基于荧光微球悬浮液相芯片。液相芯片通常被称为悬浮芯片，是由于其所有反应都是在悬浮液相中的微球表面进行的。与基因芯片不同，悬浮芯片可以结合蛋白质等多种生物分子，再通过生物亲和反应进行吸附，克服传统基因芯片的固相杂交缺点，显著提高检测效率。在食源性病原菌的检测领域，已经有针对沙门氏菌的检测试剂盒上市销售，利用悬浮芯片进行检测已经受到重视并开始研究。

3 食源性病原菌检测面临的挑战与发展方向

3.1 食源性病原菌检测面临的困难

应用于食品安全监督领域的食源性病原菌检测均属于快速检测，因此所面临的困难远高于临床病原菌检测，具体是由于食品组成复杂，部分病原菌增菌技术费时和检测方法的局限性造成的。

3.1.1 食品组成复杂

食品的种类多样，其组成基质复杂，包括碳水化合物、脂肪、蛋白质等多种化学物质，并以不同的物理形态存在，因此其中污染的细菌分布情况不规则。而且部分发酵食品，如酸奶等，自身含有正常微生物，虽然不影响健康，但是会干扰病原菌的检测工作。

3.1.2 部分病原菌增菌技术费时

虽然检测方法多样，可以显著的缩短检测时间，但是大部分方法仍然需要进行增菌培养，以提高检测的准确率。但是目前的局面是，采用的增菌技术通常不“快”，具有较高的依赖性。因此将来的研究将重点集中在增菌培养实验上，一方面增加待检测菌量，一方面去除食品中的干扰物质。

3.1.3 检测方法的局限性

快速检测方法虽然较传统检测方法，节省了检测时间，并提高了检测效率，但是仍然存在一定的局限性。首先，一些死亡的病原菌在食品中不可繁殖，但是通过免疫学或者分子生物学检测技术仍然可以检测到；其次，一部分病原菌通过分泌毒素发挥毒力，而通过检测细菌数量的方法无法判断污染这种细菌对食品安全的影响；最后，如果病原菌出现基因突变或基因缺失现象，导致检测抗原或基因无法识别，最终导致检测失败。

3.2 食源性病原菌检测技术发展方向

虽然食源性病原菌检测技术的发展困难较多，但是为保障人类的食品安全，将来仍然需要加大食源性病原菌的研发力度，开发出更快速、准确和高效的检测方法。

3.2.1 细菌的分离与富集方向

要克服检测过程中发生的干扰显著，提高病原菌的分离和富集效率是迫切需要的。如免疫磁珠技术的发展，可以对食品中分布的少量病原菌进行聚集，不同增菌实验，就可以实现检测。最近提出的膜过滤法，较免疫磁珠法更为经济，也可以到达富集待测病原菌和去除干扰物质的作用，并且操作更为简单，部分检测已经可以直接在膜上进行。

3.2.2 多重检测技术方向

食品可以被多种病原菌同时污染，而目前可进行多重检测的技术在实际工作中效果仍然难以令人满意。对于大多数的食源性病原菌检测方法来说，一次检测只能针对一种病原菌，如果检测对象较多，将会形成大量的重复工作。目前仅悬浮芯片可以实现这一目的，相对于传统检测技术，悬浮芯片检测方式更灵活，但在实际应用中仍然有较多问题需要完善。

3.2.3 定量检测和快速检测的认证与评估

目前对于快速检测技术实现定量检测仍然有一定难度，仅能保证检测结果为半定量或相对定量。然而实现食源性病原菌快速定量检测对食品中病原菌的限量标准和风险评估具有重要意义，因此将来的工作需要提高快速定量检测的研发。

4 总结

对于食源性病原菌的研究，应重点建设完善的病原菌类型以及毒力因子监督和溯源机制，并根据食源性病原菌的发展、流行和传播模式，努力寻找更高效的食源性病原菌控制技术，为我国食品安全监督事业提供准确的理论和技术支持。

[1]陈颖,王娉,杨海荣,等.食源性病原菌分型方法研究进展[J].食品安全质量检测学报,2012,3(2)：136-139

[2]唐俊妮,王琼,韦吉敏,等.洋葱汁对五种常见食源性病原细菌抑菌效果研究[J].西南民族大学学报(自然科学版),2015,41(3)：277-284

[3]高亚色,杨帆,王坤明,等.2007-2014年细菌性食源性疾病病原菌检测结果分析[J].现代预防医学,2015,42(22)：4074-4076

[4]柯碧霞,何冬梅,谭海玲,等.广东省2013-2014年食源性疾病主动监测的病原学特征分析[J].中华流行病学杂志,2016,37(10)：1373-1378

[5]李晶娇,薛峰,曾德新,等.副溶血弧菌毒力因子的研究进展[J].畜牧与兽医,2014,46(12)：116-119

[6]周莉,王永,王法云,等.食品中金黄色葡萄球菌概况及新型检测技术研究进展[J].中国酿造,2016,35(2)：1-4

[7]王跃萍,王桠男,邓慧雅,等.副溶血性弧菌引发食源性疾病的病原学检测及同源性分析[J].中国热带医学,2015,15(4)：402-404

[8]张蓉,熊建明,杨振宇,等.2011年雅安市食源性病原菌监测结果分析[J].预防医学情报杂志,2012,28(7)：548-550

[9]宋丽萍,姜洁,李玮,等.食源性致病菌快速检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报,2015(9)：3441-3446

[10]吴卫华,汤海英,张鹏飞,等.量子点标记快速免疫检测技术的研究[J].检验医学,2012,27(6)：448-450

Advances in Detection of Foodborne Pathogens in Food

ZHOU Wei，HU Liang-bin，LI Hong-bo，ZHANG Hao，MO Hai-zhen
（Food College，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

The detection technology of foodborne pathogens was very important to maintain the food safety of our country.The current detection technology mainly included traditional culture and identification methods and rapid detection methods was based on immunology and molecular biology.In this paper，the technical characteristics and application of the above methods were reviewed，and the difficulties and research methods of foodborne pathogen detection technology were analyzed.

foodborne pathogens；detection technology；immunology；molecular biology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.048

2017-02-17

河南科技学院教育教学改革研究项目（2016ZD15）；河南科技学院研究生教育教学改革研究项目（YJG2014YB03）

周威（1981—），男（汉），讲师，硕士生导师，博士，研究方向：食源性病原微生物的控制。