异甘草酸镁对H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子表达的影响

任炳楠 杨玉鹏 张焕玲 刘洪涛 田冬冬 吴 茵 魏 欣

(河北省人民医院，河北 石家庄 050051)

异甘草酸镁对H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子表达的影响

任炳楠 杨玉鹏 张焕玲1刘洪涛 田冬冬 吴 茵 魏 欣

(河北省人民医院，河北 石家庄 050051)

目的 探讨异甘草酸镁(MGIG)对肝癌小鼠模型肝癌前病变的作用。方法 通过H22细胞皮下注射建立肝癌动物模型,在制模过程中给予MGIG 50 mg/kg和5-Fu 10 mg/kg进行干预,通过免疫组化法检测肝组织中的核因子(NF)-κB p65、血管内皮生长因子(TNF)-α和血管内皮生长因子(VEGF)表达，同时检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。结果 MGIG+5-Fu组的NF-κB p65、TNF-α和VEGF表达和血清ALT、AST水平均小于5-Fu组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05%)。结论 MGIG对小鼠肝癌病变有一定的抑制作用，这种作用可能与抑制肿瘤细胞炎症因子有关。

肝癌;异甘草酸镁;核因子κB p65；肿瘤坏死因子α；血管内皮生长因子；H22细胞

异甘草酸镁(MGIG)是第4代甘草制剂，具有保护肝细胞膜、改善肝功能、延缓肝纤维化的作用，对急性肝损伤具有良好的防治作用〔1〕。研究表明甘草酸对肝纤维化过程中的炎性因子有抑制作用〔2〕，但其在肝癌中的作用尚需进一步证实。本研究应用H22细胞移植小鼠肝癌模型研究MGIG对小鼠肝组织中核因子(NF)-κB p65、肿瘤坏死因子(TNF)-α和血管内皮生长因子(VEGF)表达情况和血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平的影响，探讨MGIG对肝癌细胞炎性因子的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性昆明小鼠,6周龄,体质量(25 ±5)g,清洁级,购自河北医科大学实验动物中心(动物合格证:1503010)。颗粒状饲料购自河北医科大学实验动物中心。

1.2 药品与仪器 MGIG购自江苏正大天晴制药有限公司；H22细胞来自河北医科大学基础医学院分子生物学教研室，NF-κB p65、TNF-α和VEGF试剂盒和盐酸二氨基联苯胺(DAB)显色试剂购自博士德公司。显微镜和COMS纤维成像系统为日本奥林巴斯产品(BX51T-PHD-J11)，数据采集使用美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus，全自动生化分析仪使用日本TOSHIBA公司TBA-40FR。

1.3 分组及给药方法 53只昆明小鼠分为四组，其中随机取8只作为空白对照组，其余45只参照文献〔3〕用于建立肝癌小鼠模型，小鼠腹水型肝癌细胞株H22用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液常规传代培养。对数生长期细胞以质量分数0.9%的氯化钠溶液调整细胞密度至1×106个/ml，取0.5 ml细胞悬液接种于小鼠腹腔中，7 d后抽取小鼠腹水，用0.9%氯化钠稀释成1∶4的细胞悬液，0.2 ml/只接种于45只小鼠右侧腋窝皮下。24 h后将已经接种的小鼠随机分为三组：对照组(0.9%氯化钠注射液NS组)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组和MGIG+5-Fu组，每组15只，各组间小鼠质量差异无统计学差异(P> 0.05)。各组小鼠腹腔灌注给药(MGIG 50 mg/kg，5-Fu 10 mg/kg)，1次/d，连续给药7 d，末次给药24 h后摘取眼球取血，然后颈椎脱臼处死，解剖后观察肿瘤生长情况。

1.4 肝组织处理 取出肝脏,在右前、右后肝叶最大直径处各取2 块,用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS,pH7.0 ～ 7.6,含0.1%DEPC)进行固定，24 h 之后进行石蜡包埋。

1.5 免疫组化指标和血清中生化指标的检测 用免疫组化SP染色方法检测肝组织中NF-κB p65和VEGF及TNF-α的表达情况。切片常规脱蜡入水，使用抗原修复液水浴修复，滴加山羊血清封闭液，室温20 min。切片上滴加第一抗体，4℃过夜，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次×5 min；切片上滴加第二抗体，37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃ 20 min，0.1 mmol/L PBS洗3次×5 min；DAB显色，苏木素复染，水洗，中性树脂封片，DAB 显色，显微镜下观察。使用全自动生化分析仪测定血清ALT与AST的含量。

1.6 结果判定 末次给药24 h 后，取肿瘤组织，称质量，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量，均取平均值。免疫组化染色结果：NF-κB p65 阳性表达定位于肝细胞核和细胞质内，呈棕黄色颗粒。VEGF 染色呈棕黄色细颗粒表达于胞膜和胞质；TNF-α主要来自于单核细胞、吞噬细胞，染色呈黄色，表达于细胞膜或细胞质。参照文献〔7〕中标准，每张切片随机选择5 个视野,每个视野计数80～100个细胞,根据染色的深度及阳性细胞的数量分别计分:不着色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。阳性细胞数<1%为0 分,1%～10%为1分,11%～50%为2分,51%～80%为3分,81%～100%为4分。

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0软件行独立样本的t检验。

2 结 果

2.1 一般情况及肿瘤组织大小 实验过程中,各组均无小鼠死亡。实验组小鼠肿瘤组织直径增大。NS组的肿瘤组织质量〔(3.29±1.21)g〕最大，与5-Fu组〔(0.83±0.26)g〕和MGIG+5-Fu组〔(0.4±0.14)g〕相比差异有统计学意义(P<0.05)，5-Fu组与MGIG+5-Fu组的抑瘤率分别为56.53%、84.80%，提示MGIG与5-Fu对肿瘤增长有抑制作用。MGIG+5-Fu组肿瘤组织质量小于5-Fu组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 免疫组化染色检测结果 NF-κB p65、TNF-α和VEGF阳性细胞主要呈弥漫性分布，见图1。各实验组NF-κB p65表达和ALT、AST水平与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。与NS组相比，5-Fu组和MGIG+5-Fu组的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表达和ALT、AST水平均明显减少，差异有统计学差异。与5-Fu组相比，MGIG+5-Fu组的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表达和ALT、AST水平均明显减少，差异有统计学意义。见表1。

图1 各组积分光密度(DAB)

组别n积分光密度NF-κBp65VEGFTNF-αALT(U/L)AST(U/L)空白对照组815.85±2.214.00±1.117.38±2.33142.15±5.8833.00±2.85NS组1547.53±9.971)39.40±3.051)66.53±3.651)193.33±14.231)62.80±4.981)5-Fu组1522.33±3.861)2)16.00±1.031)2)12.67±1.251)2)169.67±4.741)2)61.73±4.451)MGIG+5-Fu组1519.33±3.861)2)3)12.93±2.261)2)3)10.93±1.611)2)3)140.80±3.432)3)33.06±2.172)3)

与空白对照组相比:1)P<0.05；与NS组相比:2)P<0.05；与5-Fu组相比:3)P<0.05

3 讨 论

肝癌的发生与NF-κB的表达密切相关，NF-κB 在肝癌组织中表达较高，是炎症致癌过程中主要的调节因子，活性增加可导致肿瘤体积增大，在炎症的刺激下，NF-κB磷酸化而抑制作用消失，使活化的 NF-κB进入细胞核而激活一系列的炎症因子〔7～10〕。在抗肿瘤的过程中抑制NF-κB 的活化可提高治疗效果。p65是NF-κB的亚基，参与调控下游基因的转录，具有转录激活的作用，可调控VEGF和TNF-α的表达，且与VEGF和TNF-α的表达正相关〔8〕。TNF-α是一种细胞因子，具有调节免疫应答、促进细胞生长分化的功能，能够活化巨噬细胞，增强淋巴细胞免疫功能，引起肿瘤血管损伤，抑制肿瘤血管形成。TNF-α体内浓度较低，适量对机体有保护作用，过量则对机体产生损伤反应〔9〕。TNF-α可通过激活NF-κB信号转导，促进肝癌细胞上皮间质转化，促进肝癌的侵袭转移〔10〕。VEGF是一种肿瘤血管生长因子，主要通过促进血管内皮细胞增殖而促进肿瘤血管生成，表达水平与肿瘤恶性程度密切相关〔11〕。NF-κB 的激活可造成肿瘤组织对化疗的抵抗而导致治疗失败，抑制NF-κB的激活可以提高化疗的疗效，延缓疾病进展和复发〔7〕。MGIG是甘草酸单一异构体镁盐，能够显著抑制炎症因子TNF-α和NF-κB p65〔12〕。本结果表明，MGIG联合5-Fu干预H22小鼠肿瘤，能够明显抑制肿瘤生长、抑制肿瘤相关因子表达和抗血管生成，同时降低肝脏细胞的损伤。MGIG联合5-Fu能够明显降低小鼠肿瘤组织NF-κB p65、TNF-α和VEGF的表达，其机制可能与阻断NF-κB 下游通路、抑制TNF-α和VEGF的表达从而抑制肿瘤细胞的生长、增殖有关。

1 汤丽娜，林 峰，沈 赞,等.异甘草酸镁治疗抗肿瘤药物引起的急性药物性肝损伤的Ⅲ期临床试验〔J〕.肿瘤,2012;32(9):738-43.

2 Tang B,Qiao H,Meng F,etal.Glycyrrhizin attenuates endotoxin-induced acute liver injury after partial hepatectomy in rats〔J〕.Braz J Med Biol Res,2007;40(12):1637-40.

3 姜 晗,任 军,崔 勇,等.小鼠原位移植性肝癌模型的建立及其磁共振表现〔J〕.现代肿瘤医学,2007;15(2):174-6.

4 姚登福,苏小琴.肝细胞核因子-κB异常激活与肝细胞癌变〔J〕.中华肝脏病杂志,2006;14(7):539-40.

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8 梁杰聪,温 哲,宋俏莉.核因子-κBp65对肝门静脉海绵样变性大鼠门静脉及其周围组织中血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子-α、内皮素表达的影响〔J〕.中国医药导报,2015;12(27):18-21.

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10 寇兴瑞，井莹莹，喻国锋,等.肿瘤坏死因子α通过核因子κB促进肝癌细胞上皮间质转化〔J〕.第二军医大学学报,2013;34(3):271-6.

11 郑安红,张维东,王兆朋,等.蝎毒多肽增强 5-氟尿嘧啶对 H22 肝癌抑制作用的机制研究〔J〕.中草药,2013;44(11):1465-9.

12 徐建国.异甘草酸镁抗皮炎湿疹药效学及其抗炎机制研究〔D〕.上海：第二军医大学,2010.

〔2016-03-18修回〕

(编辑 袁左鸣)

河北省卫生厅科研基金项目(No.20130410)

杨玉鹏(1983-),男,硕士，主治医师,主要从事抗肿瘤药物研究。

任炳楠(1983-),男,硕士,主要从事抗肿瘤药物研究。

R73

A

1005-9202(2017)06-1330-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.011

1 河北医科大学实验动物学部 河北省实验动物重点实验室