苯基乳酸耐受性大肠杆菌的筛选及其高产苯基乳酸特性

徐 艳，郭 倩，朱益波，王立梅，齐 斌,*

（1.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215000；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，苏州市食品生物技术重点实验室，发酵工程技术研究中心，江苏 常熟 215500）

苯基乳酸耐受性大肠杆菌的筛选及其高产苯基乳酸特性

徐 艳1,2，郭 倩2，朱益波2，王立梅2，齐 斌2,*

（1.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215000；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，苏州市食品生物技术重点实验室，发酵工程技术研究中心，江苏 常熟 215500）

苯基乳酸（phenyllactic acid，PLA）耐受性菌株的筛选能够有效降低PLA对生产菌株的抑制作用，有利于PLA产量的提高。通过紫外诱变的方法筛选耐受PLA的菌株，并应用于PLA的合成。以Escherichia coli BL21（DE3）作为原始出发菌株，通过紫外诱变的方法诱变筛选获得一株耐受PLA突变菌株E. coli Z2016（CCTCC保藏编号M2016332）。以E. coli Z2016为宿主菌，分别构建了重组菌株E. coli Z2016 pET-28a-ldhY52V和E. coli Z2016 pET-28a-ldhL用于D-和L-苯基乳酸的合成。结果表明：E. coli Z2016在含有1 g/L D-PLA的培养基中能够正常生长；重组突变菌株E. coli Z2016 pET-28a-ldhY52V和E. coli Z2016 pET-28a-ldhL全细胞合成D-PLA和L-PLA产量分别为6.75、6.97 g/（L·h），较重组出发菌株分别提高了14.02%和8.95%；分批补加底物反应120 min，E. coli Z2016 pET-28aldhY52V得到的D-PLA为20.02 g/L，较对照组提高22.17%，转化率为90.07%；E. coli Z2016 pET-28a-ldhL得到的L-PLA产量为20.87 g/L，较对照组提高16.85%，最终转化率为91.24%。筛选耐受性菌株是提高PLA产量的有效途径。

紫外诱变；苯基乳酸；苯基乳酸耐受菌株；大肠杆菌；全细胞转化

苯基乳酸（phenyllactic acid，PLA）是存在于蜂蜜[1-3]及乳酸菌发酵产物[4-6]中的天然有机酸，PLA对多种细菌[7]、霉菌[8-9]及酵母菌[10]具有有效的抑制作用，Schwenninger[11]和Valerio[12]等的抑菌实验结果都表明PLA的最低抑菌浓度较低，且随着pH值降低，最低抑菌浓度进一步降低，在食品行业，PLA能够抑制引起食品腐败的微生物的生长，从而延长食品的存放时间，且对人体和动物细胞无毒性，可以作为一种天然、安全的生物防腐剂使用；除此之外，PLA在药物[13-14]、化妆品[15-16]等工业中也具有广阔的应用前景。PLA结构中的第2个碳原子为手性碳原子，因此PLA有D-型与L-型2 种对映异构体。目前，高光学纯度的PLA合成研究主要集中在通过微生物全细胞转化合成[17-19]。前期研究利用Escherichia coli BL21（DE3）（pET-28a-d-ldhY52V）全细胞转化底物苯丙酮酸（phenylpyruvate，PPA），单批合成D-PLA的产量为5 g/L，转化率为75%，PPA分批补加后产量为15.6 g/L[20]；利用E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhL在60 min内将70.32 mmol/L PPA还原生成 50.59 mmol/L L-PLA，底物物质的量转化率为71.9%[21]。另有研究者通过同步糖化发酵技术发酵生产PLA，得到产量为20 g/L[22]。但是，前期研究发现，随着PLA的积累，其对微生物细胞的抑制迅速增加，进而使得PLA的合成趋于停止。因此，获得一株能够耐受一定浓度PLA的菌株将有助于打破这一瓶颈。

大量研究证明通过筛选出具有耐受性的微生物能够提高相关产物的产量[23-25]。比如，筛选耐受副产物糠醛的微生物进行水解木质纤维素，乳酸的产量提高，转化率达到96%[26]。诱变育种方法具有快速、收效大、简便等优点，是发酵工业中重要的育种方法之一。目前，紫外诱变仍然是微生物育种中常用和有效的诱变方法之一[27-28]。本研究针对常用的E. coli BL21（DE3）作为原始出发菌株，通过紫外诱变和PLA筛选获得耐受菌株，并利用该突变株构建相应工程菌株应用于合成D-PLA和L-PLA，为PLA的高产提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 菌种

表1为本研究所用菌种与质粒。

1.2 材料与试剂

胰蛋白胨、酵母提取物 英国Oxoid公司；氯化钠、葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司；D-PLA美国Sigma公司；苯丙酮酸钠、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）、6×Tartrazine DNA Loading Buffer、无毒性核酸染色剂、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、高效感受态试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；EXTaq DNA聚合酶、DNA Marker 大连宝生物公司。

1.3 仪器与设备

高速台式离心机 德国Thermo公司；恒温振荡培养箱太仓市华美生化仪器厂；高效液相色谱仪 日本岛津公司；电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；琼脂糖水平电泳槽、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 E. coli BL21（DE3）在D-PLA胁迫下存活率的测定

将E. coli BL21（DE3）接种于液体LB培养基中，37 ℃、200 r/min过夜培养。菌液经无菌生理盐水稀释至约1×106CFU/mL，分别取100 µL接种至含有0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L D-PLA的筛选培养基中，37 ℃培养12 h，分别测定不同质量浓度的PLA胁迫下菌株的存活率，根据以下公式计算。

1.4.2 紫外诱变筛选耐受性菌株

将菌液用生理盐水稀释至1×106CFU/mL左右，取2 mL倒入无菌培养皿中，在预热20 min的紫外灯（紫外灯的功率为10 W，照射距离为20 cm左右）下照射60 s，吸取0.2 mL诱变菌液接种至10 mL LB培养基，37 ℃、200 r/min暗培养12 h，然后分别吸取0.1 mL涂布筛选培养基（含1.0、1.5、2.0、2.5 g/L PLA的LB培养基）倒置培养12～24 h，记录菌落生长情况，能够在筛选培养基生长出的单菌落视为突变菌株。

1.4.3 D-PLA胁迫对突变菌株与出发菌株生长的影响

将出发菌株及突变菌株分别以1%的接种量接种至含0.5、1.0、2.0 g/L D-PLA的100 mL LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养。定时取样稀释，测定OD600nm。

1.4.4 构建重组突变菌

将质粒pET-28a-ldhY52V、pET-28a-ldhL按照高效感受态试剂盒的方法转化进E. coli Z2016构建重组菌，并对重组菌进行菌落PCR与BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证。

1.4.5 全细胞合成PLA

将活化的重组突变菌E. coli Z2016 pET-28a-ldhY52V、E. coli Z2016 pET-28a-ldhL和出发重组菌株E. coli pET-28a-ldhY52V、E. coli pET-28a-ldhL按1%的接种量接种到装有100 mL LB液体培养基（含50 µg/mL卡那霉素）的摇瓶中，37 ℃、200 r/min恒温振荡培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度1.0 mmol/L IPTG 25 ℃诱导培养8 h后，4 ℃、6 000 r/min离心10 min收集菌体，取0.3 g湿菌体用pH 7.0 磷酸缓冲液洗涤2 次后，重悬于10 mL缓冲液中（含有2%葡萄糖和10 g/L PPA），定时取样进行HPLC检测。检测方法参考文献[20]。

分批补加底物合成PLA：培养后的菌体细胞经磷酸缓冲液冲洗2 次后重悬成100 mL 30 g/L（湿质量）的菌液，加入6～7 mL 200 g/L PPA、2 g葡萄糖，于37 ℃、200 r/min条件下反应，反应30 min时，补加6 mL 200 g/L PPA，共反应120 min。每隔10 min取样进行HPLC检测。

2 结果与分析

2.1 D-PLA胁迫对E. coli BL21（DE3）存活率的影响

如图1所示，不同质量浓度的D-PLA胁迫下，E. coli BL21（DE3）的存活率变化明显。在0 g/L PLA下，E. coli存活率设为100%，增加PLA质量浓度，E. coli的存活率迅速降低，当PLA的质量浓度为0.5 g/L时，E. coli的存活率为47.3%，1 g/L PLA胁迫时，E. coli的存活率为5.56%，继续增加PLA质量浓度，E. coli存活率为0。D-PLA能够抑制E. coli BL21（DE3）的生长，且质量浓度越高，存活率越低。D-PLA的抑菌作用高于L-PLA[29]，在D-PLA胁迫下的突变菌株具有更高的应用价值。

2.2 突变菌株筛选结果及D-PLA胁迫对突变菌与对照菌生长的影响

经多轮筛选，最终在一个2 g/L D-PLA 的LB培养基上获得一个单菌落。该单菌落经分离纯化后命名为E. coli Z2016，并将其保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号M2016332。在含有1 g/L D-PLA 的LB培养基上，原始菌株与突变菌株的生长情况见图2，突变菌株在含有1 g/L D-PLA的LB培养基上长出单菌落，且形态良好，而原始菌株在该培养基中没有单菌落出现。

突变菌株与原始菌株在含不同浓度D-PLA的LB培养基中生长情况如图3所示，突变菌株与原始菌株在不含D-PLA的培养基正常生长，且到达稳定期时OD600nm数值基本一致；在1 g/L D-PLA胁迫时，原始菌株几乎不能生长，突变菌株能够正常生长；2 g/L D-PLA胁迫时，突变菌株也能够生长，但生长速率和稳定期细胞数量比1 g/L D-PLA条件下有明显下降。结果表明，通过诱变筛选得到的突变菌株E. coli Z2016比原始出发菌株能够耐受更高质量浓度的PLA。

2.3 重组表达质粒的酶切验证与菌落PCR验证

将表达质粒pET-28a-ldhY52V、pET-28a-ldhL转化感受态E. coli Z2016并进行验证，结果如图4所示，经过菌落PCR均得到一条1 000 bp左右的条带，双酶切验证结果分别得到一条1 000 bp和5 000 bp左右的条带，均与理论值一致。验证结果表明表达质粒均成功转入E. coli Z2016感受态细胞。

2.4 重组突变大肠杆菌全细胞转化合成PLA

重组突变菌株与对照菌株在相同条件下全细胞合成PLA，PLA的产量如图5所示。在相同条件下，突变重组菌株合成6.75 g/L D-PLA，较对照组产量（5.92 g/L）提高了14.02%。L-PLA产量6.90 g/L，比对照组（6.32 g/L）提高了8.95%。结果表明本研究中构建的重组突变菌株，在合成D-PLA和L-PLA过程中，均使得产物产量获得明显增加。分批补加底物的条件下反应120 min，E. coli Z2016 pET-28a-ldhY52V合成的D-PLA为20.02 g/L，比E. coli pET-28a-ldhY52V的产量16.37 g/L增加了22.17%，产率为10.01 g/（L•h），最终转化率为90.07%，与Zhu Yibo等[20]的研究相比，PLA的产量与转化率均有所增加。蒋卓越等[19]构建E. coli pET-28a-DLDHY52L合成D-PLA 18.47 g/L，转化率为65.96%，Wang Min等[31]利用E. coli JM109 pET-28a-M307L合成D-PLA，得到D-PLA产量为21.43 g/L，转化率为82.3%，转化率和D-PLA的产率都低于本研究所得。E. coli Z2016 pET-28a-ldhL合成的L-PLA为20.87 g/L，与E. coli pET-28a-ldhL产量17.83 g/L相比增加了16.85%，最终转化率为91.24%，产率为10.435 g/（L•h），高于王颖等[21]的研究。Zheng Zhaojuan等[30]通过构建重组菌E. coli pETDuet-ldhL-fdh得到L-PLA产量为13.214 g/L。

此外，重组突变菌合成的PLA在反应后期仍有小幅增长（图6B、D），而原始重组菌合成的PLA在反应后期不再有明显增加。由耐受性大肠杆菌构建的重组菌合成的PLA产量高于原始重组菌，为增加PLA产量提供新的思路。

3 结 论

紫外诱变筛选能够获得对PLA耐受性提高的E. coli BL21（DE3）突变株。突变株E. coli Z2016对于D-PLA的耐受性显著提高，能够在含1 g/L PLA的LB培养基中正常生长。以E. coli Z2016为宿主菌构建的重组突变菌株，其全细胞合成D-PLA与L-PLA的产量和转化率与对照菌株相比，均有明显提高。提高菌株对于PLA的耐受性是进一步强化生物合成PLA及其类似物的有效策略。

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Screening of Phenyllactic Acid-Resistant Escherichia coli and Its Application in the Synthesis of Phenyllactic Acid

X
U Yan1,2, GUO Qian2, ZHU Yibo2, WANG Limei2, QI Bin2,*
(1. School of Biology & Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215000, China; 2. Key Laboratory of Food and Biotechnology of Suzhou, Fermentation Engineering Technology Research Center, College of Biological and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Screening phenyllactic acid (PLA)-resistant strains enables effective reduction of the inhibitory effect of PLA on the synthesis process and thus an increase in PLA production. In this report, Escherichia coli BL21 (DE3) was mutagenized by UV irradiation and screened for a mutant resistant to PLA, E. coli Z2016 (CCTCC Accession No. M2016332). E. coli Z2016 was used the host strain to construct recombinant strains E. coli Z2016 pET-28a-ldhY52Vand E. coli Z2016 pET-28a-ldhL for the synthesis of D- and L-PLA. The results showed that E. coli Z2016 was able to grow normally in a medium containing 1 g/L D-PLA. The production of D- and L-PLA by the recombinant strains were 6.75 and 6.97 g/(L·h), which were increased by 14.02% and 8.95% as compared to those produced by the original strain, respectively. During 120 min of fed-batch fermentation, the production of D-PLA by E. coli Z2016 pET-28a-ldhY52Vwas 20.02 g/L with a conversion rate of 90.97%, which was increased by 22.17% as compared to that produced by the control. The L-PLA concentration produced by E. coli Z2016 pET-28a-ldhL was 20.87 g/L, which was increased by 16.85% as compared to produced by the control, with a conversion rate of 91.24%. Accordingly, the use of PLA-resistant strains provided an effective method to increase PLA production.

UV mutagenesis; phenyllactic acid; phenyllactic acid-resistant strain; E. coli; whole-cell transformation

10.7506/spkx1002-6630-201714004

TS201.2

A

1002-6630（2017）14-0024-06

2016-10-14

国家自然科学基金面上项目（31470092）；国家自然科学青年科学基金项目（31501459）；江苏省“六大高峰人才”资助计划项目（NY-021）

徐艳（1992—），女，硕士研究生，研究方向为微生物学。E-mail：1617374705@qq.com

*通信作者：齐斌（1965—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：qibin65@126.com

引文格式：徐艳, 郭倩, 朱益波, 等. 苯基乳酸耐受性大肠杆菌的筛选及其高产苯基乳酸特性[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 24-29.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714004. http://www.spkx.net.cn

XU Yan, GUO Qian, ZHU Yibo, et al. Screening of phenyllactic acid-resistant Escherichia coli and its application in the synthesis of phenyllactic acid[J]. Food Science, 2017, 38(14): 24-29. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714004. http://www.spkx.net.cn