LC-MS技术在藤黄属植物化学成分研究中的应用＊

党泽方，谭红胜，付文卫＊＊

（1.上海中医药大学中药学院上海201203；2.中药创新药物研发上海高校工程研究中心上海201203）

LC-MS技术在藤黄属植物化学成分研究中的应用＊

党泽方1，2，谭红胜1，2，付文卫1，2＊＊

（1.上海中医药大学中药学院上海201203；2.中药创新药物研发上海高校工程研究中心上海201203）

藤黄属植物有着重要的经济及药用价值，一直以来都作为食品和民间药物被广泛使用，随着现代分析技术的发展，越来越多的植物化学研究也应用于藤黄属植物，其中，液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术以其快速、精确等特点，被越来越多的研究者用于藤黄属植物的化学研究。本文根据已发表文献，通过总结LC-MS技术在藤黄属植物化学成分的定性研究、辅助发现新化合物，以及定量研究等方面的应用进展，阐述LC-MS技术在藤黄属植物化学研究中的研究现状，为今后藤黄属植物化学研究工作提供一定参考。

藤黄属植物LC-MS定性研究定量研究植物代谢组学

藤黄属植物（Garcinia Linn.）约有450种，产于热带亚洲、非洲南部及波利尼西亚西部。其中，分布于中国的有21种，产自台湾南部、福建、广东、海南、广西南部、云南南部和西南部至西部、西藏东南部、贵州南部及湖南西南部[1]。该属植物中的主要活性物质包括■酮类（xanthones）、多环多异戊烯基间苯三酚类化合物（Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinols，PPAPs）、双黄酮类（biflavonoids）等化合物[2]。

LC-MS联用技术是继GC-MS联用技术之后又一新兴的分离检测技术，近年来发展极为迅速，在生命科学、环境科学、法医学、商检等领域得到了广泛应用。LC-MS技术在具有液相色谱对复杂样品的分离能力的同时又具有质谱高灵敏度、高选择性和提供相对分子质量和碎片结构等优点，被广泛应用于复杂样品的分析。LC-MS接口装置可以分为电喷雾（Electrospray Ionization，ESI）、大气压化学电离（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）和大气压光电离（Atmospheric Pressure Photoionization，APPI）等；根据质量分析器的不同又分为单级四极杆质谱（Quadrupole Mass Spectrometry，QMS）、三级四极杆质谱（Triple Quadrupole Mass Spectrometry，TQMS）、离子阱质谱（Ion Trap Mass Spectrometry，ITMS）、飞行时间质谱（Time of Flight，TOF）及傅立叶变换质谱（Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance，FTICR）等；此外，为了得到更多结构信息，LC-MS的质谱部分经常采用串联质谱技术，例如Q-TOF、TOF-TOF、Q-Trap、IT-TOF等[3，4]。本文综合近几年发表的运用LC-MS技术研究藤黄属植物相关文献，对在LC-MS技术应用于藤黄属植物化合物鉴定中发现的新思路、新方法加以阐述，对今后藤黄属植物的化学研究提供一定的指导。

1 运用LC-MS定性鉴别藤黄属植物中的化合物

1.1 定性分析藤黄属植物中成分

藤黄属植物中含有■酮类（xanthones）、多环多异戊烯基间苯三酚类化合物（PPAPs）类化学成分，其质谱的裂解规律并不相同。通过不同的裂解规律和特征碎片，往往可以对这两类化合物进行鉴别。另外，QTOF往往提供了准确的分子量信息，进行可以获得相应化合物的分子式，可以用于已知化合物的快速鉴定。因此，LC-MS技术经常作为藤黄属植物化合物的定性研究常用手段。此外还有研究者利用LC-MS技术分析藤黄属植物中活性化合物在体内的代谢物，分析其在体内的药物代谢动力学特征。

Zhou Y等[5]应用HPLC-ESI-QTOF-MS/MS/MS从版纳藤黄中分析鉴定出15种多异戊烯基取代的■酮类化合物，本研究中MS/MS用来分析分子离子及其产生的碎片离子，而三级质谱则用来进一步分析碎片离子，由此可发现■酮骨架的逆狄尔斯-阿尔德重排和与其相关的碎片离子，从而可以区分A环或B环含异戊二烯结构的位置异构体。JiX H等[6]利用液相-光二极管阵列（Liquid Chromatography-Photodiode Array，LC-PDA）检测器对莽吉柿中6种■酮类化合物（3-isomangostin，8-desoxygartanin，gartanin，α-mangostin，9-hydroxycalabaxanthone，β-mangostin）进行定量检测，并进一步利用LC-TOF-MS将6种■酮类化合物标准品峰与莽吉柿中对应的6种化合物进行比较，确认莽吉柿中所含的6种化合物与标准品相同，从而得出一种对莽吉柿中这6种■酮类化合物的定量检测方法。Thomas Michel等[7]将离心分配色谱（Centrifugal Partition Chromatography，CPC）与HPLC-DAD-MS在线连接，此方法可以在离心分配色谱将植物粗提物分馏的同时，利用HPLC-DAD得到各个组分的指纹图谱信息并通过MS得到各组分中化合物的结构信息，作者采用这种串联方法从莽吉柿乙醇提取物中得到33mg纯度98%的α-mangostin和6 mg纯度98.5%的γmangostin，此外，还从莽吉柿醇提物中得到其他16种■酮，其中10种通过紫外图谱和质谱数据进行了结构确定。周安等[8]采用HPLC-PDA-ESI/MSn联用技术分离并检测出藤黄药材中的16种化合物，并且根据色谱保留时间、PDA光谱图、MS获得的准分子离子峰及碰撞诱导裂解（Collision-induced Dissociation，CID）技术获得碎片峰信息，结合文献鉴定了其中10种化合物的可能结构，该研究还采用HPLC-ESI/MS研究新藤黄酸和藤黄酸在正离子检测方式下的一级质谱和多级质谱，归纳其碎裂规律。Han SY等[9]采用UPLC-MS/MS测定莽吉柿中活性成分α-Mangostin在小鼠体内的代谢成分，以此来推测α-Mangostin在体内的ADME特征，为α-Mangostin的临床前研究提供重要的基础。

Zhou Y等[10]采用UPLC-QTOF-Precursor Ion Discovery（PID）从9种藤黄属植物的29个样品中快速鉴定9种含有特征碎片m/z177.02产物离子的PPAPs，包含两类同分异构体，其中一类包括6种PPAPs（分子质量602.360 7），另外一类包括3种PPAPs（分子质量670.423 3）。Zhang H等[11]利用UPLC-IM-MSE和UPLC-IM-MS/MS从岭南山竹子中检测出140种PPAPs，该研究根据两个PPAPs诊断离子m/z165.018 2和m/z177.018 2快速扫描分析得到140种PPAPs，其中10种利用保留时间，一级质谱和二级质谱数据进行鉴定，7对高分辨质谱不能区分的共洗脱同分异构体利用UPLC-IM-MS被区分开，这种策略也为其他复杂成分样品的快速共洗脱同分异构体提供了解决方法。

1.2 结合代谢组学方法分析藤黄属植物中的化学成分

代谢组是指某一细胞、组织或机体在一定的生理或环境条件下所有低分子量的代谢产物（基因表达产物），植物代谢组学则是通过整体分析的方法对植物代谢物组同时进行无偏定性和定量分析[12]。Fiehn[12]把广泛应用于植物的代谢组学研究策略分为4个层次，即代谢物靶标分析、代谢物谱分析、代谢物组分析和代谢指纹分析。植物代谢组学高通量检测分析植物中的代谢物成分必然产生大量的数据，需要采用生物信息学方法从中获取有意义的信息。目前常用的数据分析方法有主成分分析（PrincipalComponentAnalysis，PCA）、层次聚类分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）、自组织映射网络（Self-organizing Map，SOM）等非监督方法，以及偏最小二乘法-判别（Partial Least Squares-Discrimination，PLS-DA）、k-最近邻法、神经网络（NeuralNetwork，NN）等监督方法[13]。

Timo D S等[14]利用UPLC-ESI-TOFMS分析食物保健品Garcinia buchananii三个部位根、树皮、叶的代谢物成分，结合PCA和OPLS-DA发现，GB-1、morelloflavone和volkensiflavone等黄酮类化合物主要在叶、根中■酮类化合物含量最高，manniflavanone等黄酮类化合物在树皮中含量较高。Morelloflavone、volkensiflavone和garcicowin C表现出一定的抗氧化活性，可能为Garcinia buchananii抗氧化成分。Li P等[15]利用UPLC-QTOF-MS和MSE从岭南山竹子的叶、枝和果实中鉴定出40种双黄酮、■酮和苯甲酮类化合物，并结合热图（Heatmap）分析和PCA分析发现三个部位间化学成分存在较大差异，■酮类化合物在枝中含量最高，细胞毒实验和抗氧化实验结果也显示枝提取物活性最强，这提示■酮类化合物可能是岭南山竹子中主要的活性成分，该研究还利用OPLS-DA结合S-plots分析，发现12种标志化合物，其中10种为■酮类化合物和2种双黄酮类化合物。

表1 四级质谱法与飞行时间质谱法定量分析比较

2 利用LC-MS技术辅助发现藤黄属植物中的新化合物

由于藤黄属xanthones和PPAPs两类化合物有其特征的质谱裂解规律和特征碎片，因而常用来指导化学成分的分离工作。以LC-MS为导向的提取分离工作，可以有效的避免传统方法的盲目性，能够快速有效的发现可能的新化合物，提高提取分离工作效率。

Yang J等[16]采用LC-MS/MS从藤黄树脂中分析检测出34种笼状■酮类化合物，并推测18种可能是新化合物，本研究包含三个部分：①根据已知的笼状■酮结构和生物合成知识来预测藤黄树脂中可能的未知笼状■酮结构；②根据已知的藤黄笼状■酮类化合物的诊断碎片离子（Diagnostic Fragment Ions，DFIs）进行结构分类；③运用多种质谱扫描模式对藤黄树脂中的目标和非目标笼状■酮进行检测和表征。

Zhang H等[11]利用PPAPs质谱特征离子峰，对岭南山竹子中PPAPs成分进行快速筛选，根据保留时间、分子碰撞截面积（Collision Cross-Section，CCS）、精确的母离子和子离子质量和二级质谱数据，发现129种未见报道的潜在新PPAPs化合物，运用此方法可以快速筛选藤黄属植物中的PPAPs化合物，发现其中潜在的新型结构。

Li P等[17]利用UPLC-QTOF-MSE技术对金丝李种子乙醇提取物硅胶柱分段的9个部分分别进行检测，发现其中31个峰可能包含新的苯甲酮类衍生物，通过SciFinder数据库检索排除其中19个峰，其余12个峰经过综合分析，推断出6个基本的结构单位，而后通过Sephadex LH-20和制备HPLC等手段，从相应粗提物部分得到5个新的苯甲酮类化合物，其结构通过NMR、 MS、IR和ECD光谱得以确定。

3 LC-MS技术应用于定量检测藤黄属植物化学成分

质谱检出的离子流强度与离子数目成正比是质谱定量的基本原理，通过离子流强度的测量可进行定量分析。LC-MS数据采集形式主要有：总离子流（Total Ion Current，TIC）、选择离子监测（Select Ion Monitoring，SIM）、选择反应监测（Selected Reaction Monitoring，SRM）和多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）等，也可以从TIC中提取待测离子的离子流，即提取离子流（Extraction Ion Current，EIC）进行定量。质谱定量分析可采用内标法和外标法，因内标法可减少仪器误差，因此质谱定量分析常采用内标法。四级杆质谱法和飞行时间质谱法是两种最常用的定量质谱法，表1是两种方法的比较。藤黄属植物的质谱定量研究主要集中于两种结构相似的化合物的定量测定，或者定量测定不同藤黄属植物中某类化学成分的含量。

Bharate JB等[18]从印度藤黄果实中提取出一对同分异构体garcinol和isogarcinol，采用LC/ESI-MS/MS的MRM模式对两种化合物进行定量分析，garcinol的定量限和检测限分别为0.06 ng·mL-1和0.021 ng·mL-1，isogarcinol定量限和检测限分别为0.05 ng·mL-1和0.017 ng·mL-1，而后作者对印度藤黄果实不同溶剂提取物中的garcinol和isogarcinol进行定量分析，定量结果良好。Chattopadhyay SK等[19]利用已知方法从印度藤黄果皮中提取纯度98%的xanthochymol和isoxanthochymol，采用LC-MS/MS的MRM模式对两种化合物进行定量分析，xanthochymol在5-125 ng·mL-1线性良好（R2=0.997 3），检测限为1 ng·mL-1，isoxanthochymol在4-50 ng·mL-1线性良好（R2= 0.997 8），检测限为0.5 ng·mL-1。此外，该研究还对印度藤黄和藤黄果不同部位两种化合物含量进行测定定量结果良好，结果表示本方法可作为xanthochymol和isoxanthochymol快速精确的定量方法。

Pandey R等[20]利用UPLC-QqQLIT-MS/MS的MRM模式对11种不同藤黄属植物叶中26种活性成分进行定量测定，该研究中26种活性化合物标准品经HPLC测定纯度均在95%以上，化合物结构经MS和NMR进行确认，26种化合物标准曲线线性良好（R2＞0.999）,日间和日内精密度RSD≤1.93%，回收率范围是95.45%-104.43%，且RSD≤1.89%，研究中作者还根据定量数据结合PCA和HCA对11种藤黄属植物的活性化合物含量进行比较，结果显示11种植物存在显著的生物差异。

Zhou Y等[21]利用UPLC-Q-TOF定量测定了来自10种藤黄属植物的32个样品中的16种PPAPs，16种PPAPs都为作者实验室以往分离提取所得，经HPLCDAD和UPLC-MS测定纯度均在95%以上，该实验中16种PPAPs检测限为2.7-21.4 ng·mL-1，日间和日内精密度RSD≤3.7%，回收率89%-107%（RSD≤9.0%），实验结果表明本研究方法适用于藤黄属植物中PPAPs的精确定量测定。

4 总结与展望

藤黄属植物一直以来作为民间用药和食物保健品被广泛用于中外各国，很多种从藤黄属植物中提取分离的化合物因其抗氧化、抗肿瘤及免疫活性收到越来越多研究者的关注。而随着LC-MS技术的不断进步发展，专注于藤黄属植物的研究者也将这一技术从不同方面应用于藤黄属植物化合物的定性、定量及新化合物发现的研究工作中，从本文所引文献中可以发现近几年来，LC-MS技术应用于藤黄属植物的研究深度和广度在大大增加，各种新思路新方法不断涌现。相信随着LC-MS技术的不断发展，LC-MS与其他技术手段联合应用的开发，LC-MS技术应用于藤黄属植物的研究工作必将更加广泛更加深入。

1 Li XW L J,Stevens P F.Flora of China.Beijing：Science Press,2007：40-47.

2 Hemshekhar M,Sunitha K,Santhosh M S,et al.An overview on genus garcinia：phytochemical and therapeutical aspects.Phytochem Rev, 2011,10(3)：325-351.

3关天野,梁艳,李春竹,等.液相色谱/质谱联用技术的新进展和中药研究的相关热点问题.中国天然药物,2011,9(5)：385-400.

4 Holcapek M,Jirasko R,Lisa M.Recent developments in liquid chromatography-mass spectrometry and related techniques.JChromatogr A,2012,1259：3-15.

5 Zhou Y,Han Q B,Song J Z,et al.Characterization of polyprenylated xanthones in Garcinia xipshuanbannaensis using liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem massspectrometry.JChromatogrA,2008,1206(2)：131-139.

6 Ji X,Avula B,Khan IA.Quantitative and qualitative determination of six xanthones in Garciniamangostana L.by LC-PDA and LC-ESI-MS. JPharm Biomed Anal,2007,43(4)：1270-1276.

7 Michel T,Destandau E,Fougere L,et al.New"hyphenated"CPCHPLC-DAD-MS strategy for simultaneous isolation,analysis and identification of phytochemicals：application to xanthones from Garcinia mangostana.Anal BioanalChem,2012,404(10)：2963-2972.

8周安,李庆林,彭代银,等.高效液相色谱-质谱联用法鉴定中药藤黄中桥环类化合物.药学学报,2008,43(8)：838-842.

9 Han SY,You BH,Kim Y C,etal.Dose-IndependentADMEProperties and Tentative Identification of Metabolites of alpha-Mangostin from Garciniamangostana in Mice by Automated Microsampling and UPLCMS/MSMethods.PloSOne,2015,10(7)：e0131587.

10 Zhou Y,Huang S X,Song J Z,et al.Screening of Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinols from Garcinia Species Using Precursor Ion Discovery(PID)Scan and Ultra Performance Liquid Chromatography Electrospray Ionization Q-TOF Tandem Mass Spectrometry.JAm SocMassSpectrom,2009,20(10)：1846-1850.

11 Zhang H,Zheng D,Li H H,et al.Diagnostic filtering to screen polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols from Garcinia oblongifolia by ultrahigh performance liquid chromatography coupled with ion mobility quadrupole time-of-flightmass spectrometry.Anal Chim Acta, 2016,912：85-96.

12 Fiehn O,Kopka J,Dormann P,et al.Metabolite profiling for plant functionalgenomics.NatBiotechnol,2000,18(11)：1157-1161.

13郭宾,戴仁科.代谢组学及其研究策略和分析方法进展.中国卫生检验杂志,2007,17(3)：554-563.

14 Stark T D,Losch S,Wakamatsu J,et al.UPLC-ESI-TOFMS-Based Metabolite Profiling of the Antioxidative Food Supplement Garcinia buchananii.JAgric Food Chem,2015,63(32)：7169-7179.

15 Li P,AnandhiSenthilkumar H,Wu SB,etal.Comparative UPLC-QTOFMS-basedmetabolomicsand bioactivitiesanalysesof Garcinia oblongifolia. JChromatogrBAnalTechnolBiomed Life Sci,2016,1011：179-195.

16 Yang J,Ding L,Hu L,et al.Rapid characterization of caged xanthones in the resin of Garcinia hanburyi using multiple mass spectrometric scanning modes：the importance of biosynthetic knowledge based prediction.JPharm Biomed Anal,2012,60：71-79.

17 Li P,AnandhiSenthilkumar H,Figueroa M,et al.UPLC-QTOFMS(E)-Guided Dereplication of the Endangered Chinese Species Garcinia paucinervis to Identify Additional Benzophenone Derivatives.J Nat Prod,2016,79(6)：1619-1627.

18 Bharate JB,Vishwakarma R A,Bharate SB,etal.Quantification of thePolyisoprenylated Benzophenones Garcinol and Isogarcinol Using Multiple Reaction Monitoring LC/Electrospray Ionization-MS/MS Analysis of Ultrasound-Assisted Extracts of Garcinia indica Fruits.J AOAC Int,2014,97(5)：1317-1322.

19 Chattopadhyay S K,Kumar S.Identification and quantification of two biologically active polyisoprenylated benzophenones xanthochymol and isoxanthochymol in Garcinia species using liquid chromatographytandem mass spectrometry.JChromatogr B-Anal Technol Biomed Life Sci,2006,844(1)：67-83.

20 Pandey R,Chandra P,Kumar B,et al.Simultaneous determination of multi-class bioactive constituents for quality assessment of Garcinia species using UHPLC-QqQ LIT-MS/MS.Ind Crop Prod,2015,77：861-872.

21 Zhou Y,Lee S,Choi F F,et al.Qualitative and quantitative analysis of polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols from Garcinia species using ultra performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.AnalChim Acta,2010,678(1)：96-107.

TheApplication of LC-MSTechnique to the Chem icalCom ponentAnalysisof Garcinia Linn.

Dang Zefang1,2,Tan Hongsheng1,2,FuWenwei1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering Research CenterofShanghaiCollegesforTCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China)

Various species of Garcinia Linn.have been widely used as food and folk medicines,for their significant economic and pharmaceutical values.As the development ofmodern analysis technology,many phytochemistrymethods were applied in the research of Garcinia Linn.,in which especially the liquid chromatography coupled with mass spectrometry(LC-MS),was increasingly used in chemical study for its rapid and accurate analysis.In this article,based on the published articles,the LC-MSmethodsused in the study of Garcinia Linn.,including the qualitative analysis,new compounds discovery and quantitative analysis were reviewed,and it would provide some information for the study of Garcinia Linn.in the future.

Garcinia Linn.,liquid chromatography coupled with mass spectrometry,qualitative analysis,quantitative analysis,plantmetabolomics

10.11842/wst.2017.02.012

R93

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2017-02-20

修回日期：2017-02-20

＊上海中医药大学预算内项目（2013JW08）：单花山竹子抗肿瘤活性成分研究，负责人：付文卫；中药学一流学科创新基金（ZYX-CXYJ-012）：单花山竹子、大苞藤黄以及大果藤黄抗肿瘤有效部位的化学成分及作用机制研究，负责人：付文卫。

＊＊通讯作者：付文卫，副研究员，硕士研究生导师，主要研究方向：中药活性成分研究。