云南省德宏州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性

贺晓辉，肖志新，宋玉川，胡志明，王 杰，李义强，王凤龙

（1.云南省香料烟有限责任公司，云南 德宏州 678400；2.中国农业科学院 烟草研究所，山东 青岛 266101；3.云南省烟草公司保山市公司，云南 保山 678000）

云南省德宏州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性

贺晓辉1，肖志新3，宋玉川1，胡志明3，王 杰2，李义强2，王凤龙2

（1.云南省香料烟有限责任公司，云南 德宏州 678400；2.中国农业科学院 烟草研究所，山东 青岛 266101；3.云南省烟草公司保山市公司，云南 保山 678000）

为明确新开发烟叶生产区云南省德宏州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性现状，从德宏州13个县市采集68株烟草黑胫病菌株，采用菌丝生长速率法测定了烟草黑胫病菌株对烯酰吗啉的敏感性和抗药水平。结果表明，烯酰吗啉抑制烟草黑胫病菌菌丝生长的EC50范围为0.462 8~2.575 2 μg/mL，平均EC50为1.388 1 μg/mL，属于中抗水平。统计分析表明，烟草黑胫病菌68个菌株菌丝生长对烯酰吗啉的敏感性符合正态分布，最不敏感菌株的EC50值为最敏感菌株的5.56倍。烯酰吗啉对德宏州烟草黑胫病仍有较高活性，但应与其他杀菌剂进行合理的轮换使用。

烟草黑胫病菌；烯酰吗啉；抗药性水平

烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora parasitica var．nicotianae(Breda de Hean)Tucker）引起的一种破坏性极强，危害严重的真菌性土传病害。该病在我国各烟草产区大量发生，是仅次于烟草病毒病的病害，严重影响了烟草的产量和品质[1-2]。因德宏州潮湿、多雨条件较适宜烟草黑胫病菌的生长繁殖，再加上主栽品种为品质较好的易感病品种“红花大金元”，致使近期德宏州烟叶生产区烟草黑胫病发病严重，平均发病率为20%～40%，严重田块发病率高达70%～80%，甚至造成绝产，每年给烟农造成严重的经济损失[3-5]。目前，防治烟草黑胫病主要通过采用抗病品种、栽培防治、化学防治等措施，其中化学防治是最普遍且实用的方法，但是病菌极易对常规杀菌剂产生抗药性[6]。因此，为了有效地对黑胫病进行防治，急需筛选出一批安全、高效的杀菌剂进行合理的替代或轮换。

烯酰吗啉是一种防治疫霉属高效内吸性羧酸氨基类杀菌剂，对疫霉属细胞壁具有独特的作用方式[7]。其防治范围为卵菌纲病原菌引起的葡萄、黄瓜、白菜霜霉病、番茄、马铃薯、辣椒疫病、大豆疫霉根腐病、烟草黑胫病等。近年来，我国大部分烟区已开始使用烯酰吗啉类杀菌剂对该病害进行防治[8-9]。因此研究烟草黑胫病菌田间菌株对烯酰吗啉的敏感性及其抗药性风险，对预测病原菌抗药群体的发展动态和制定抗性治理策略具有重要的意义。本研究首次分析了新开发烟叶生产区云南省德宏州烟草黑胫病菌对杀菌剂烯酰吗啉的敏感性，旨在建立烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线，并对德宏州烟草黑胫病菌的抗药性水平进行监测，以期为田间抗药性风险的评估和抗性治理提供理论依据，指导烟草安全生产。

1 材料与方法

1.1 烟草黑胫病菌的分离

2013从云南省德宏州种植烤烟品种“红花大金元”、KRK26、云烟87的10个县市和种植香料烟的3个县市不同烟区采集具有黑胫病典型症状的病株，于加有抗生素的选择性黑麦培养基（RSA）上分离纯化所得，总共得到68个菌株。所有烟草黑胫病菌菌株黑暗保存于10oC菌种保存柜。经分子鉴定菌株生理小种种类和具体分布见表1。

1.2 供试药剂

供试的95%烯酰吗啉原药用分析纯丙酮溶解，配制成10 μg/mL贮液，保存于4oC冰箱中备用。

1.3 烯酰吗啉敏感基线的建立

分别对不同烟区68个菌株用含药平板法进行烯酰吗啉敏感性测定。供试菌株在黑麦培养基上25oC黑暗培养5~7 d后，分别配制含烯酰吗啉0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/mL的8个不同浓度梯度的V8汁选择性培养基平板。

用直径为5 mm的打孔器在相同圆周的菌落边缘上切取菌饼，将菌饼正面朝下，分别接种到含烯酰吗啉系列浓度梯度的V8培养基平板上（直径9 cm），每处理3次重复，置于25oC恒温培养箱中黑暗培养3 d后，用十字交叉法测量菌落生长直径。根据菌落直径计算出生长量，计算烯酰吗啉各浓度梯度对黑胫病菌菌丝生长抑制的百分率。

通过SPSS13.0软件，将药剂浓度转化成对数（x），抑制率转化成机率值（y），建立其毒力回归方程y=bx+a，根据x与y的线性关系计算出相关系数（R）、烯酰吗啉对黑胫病菌各菌株抑制中浓度EC50值（菌丝生长50%的有效质量浓度），并进行正态分布检验。

根据王文桥等[10]的方法进行烟草黑胫病菌抗性水平划分，将菌株分为抗性菌株（EC50＞10 μg/mL）、中间型菌株（0.1 μg/mL≤EC50≤10 μg/mL）和敏感菌株（EC50＜0.1 μg/mL）。

2 结果

2.1 烟草黑胫病菌对烯酰吗啉敏感性测定结果

根据相关文献描述的烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线，选择含药0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的5个浓度梯度，测定2013年从德宏州分离纯化的烟草黑胫病菌菌株对烯酰吗啉的敏感性。从表2可以看出，从德宏州13个县市分离获得的烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的EC50值在0.462 8~2.575 2 μg/mL，平均EC50为1.388 1 μg/mL，表明所测菌株属于中间型菌株。其中，最敏感菌株来自梁河芒东LD4，EC50值为0.462 8 μg/mL，而抗药性水平最高的菌株为盈江弄璋的YN3，其EC50值是2.575 2 μg/mL，为菌株LD4的5.56倍。在所测定的68个菌株中，值得注意的是芒市孟戛、遮放，陇川城子、户撒和盈江弄璋生产区分离到的烟草黑胫病菌，其EC50值相对其他区域稍高，在今后黑胫病防控措施中应采取合理的杀菌剂轮换施用，避免长期使用靶标单一的杀菌剂后因高选择压而导致产生高抗药性菌株。

2.2 烟草黑胫病菌对烯酰吗啉敏感性分布

在烟草黑胫病菌对药剂的敏感性变化范围内，将EC50等分为10个阶段，统计出每个阶段菌株的个数和频率，然后以每个阶段EC50的中值为横坐标，频率为纵坐标，作出频率分布图（图1），结果表明烟草黑胫病菌丝对烯酰吗啉的敏感性呈单峰曲线，经K-S正态性检验，得到Z=0.120 1，P=0.695，表现较好的连续性，表明德宏州13个县市的68个烟草黑胫病菌株对烯酰吗啉敏感性的频率分布符合正态分布。

3 讨论

烯酰吗啉对疫霉卵菌纲的作用特点是首先影响细胞壁分子结构的重新排列，然后干扰病原菌细胞壁聚合体的组装，从而干扰细胞壁的形成和促使孢子囊壁的分解，使病原菌出现自动死亡，对病菌作用位点单一。病菌易发生突变，产生抗药性[11]。鉴于烯酰吗啉在防治疫霉过程中易产生抗药性菌株，国内外陆续开展了烯酰吗啉对烟草黑胫病菌的敏感性、抗性水平、生物活性及防治效果方面的相关研究[12-16]。本研究在前人研究的基础上，对德宏州13个县市的红花大金元、KRK26、云烟87和香料烟烟区分离获得的烟草黑胫病菌的敏感性、抗药性水平进行了监测，结果显示德宏州68个烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的EC50值在0.462 8~2.575 2 μg/mL之间，平均为1.388 1 μg/mL，抗药性水平与战徊旭等[12]2010年测定的泸州田间24个烟草黑胫病菌菌株对烯酰吗啉的EC50（0.110～1.615 μg/mL）值相比，抗药性水平有所增加；与大理的0.587 8~2.525 4 μg/mL相似[13]，但明显低于苏凯等[14]测定的贵州省47个烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的的抗药性水平（EC50范围为0.792 6～4.232 7 μg/mL），由此可以判定烯酰吗啉对德宏州生产区烟草黑胫病菌仍有较好的防控效果，而且烯酰吗啉与甲霜灵没有交互抗性。朱桂宁等[15]报道50%烯酰吗啉可湿性粉剂对烟草黑胫病的防效显著优于常用药剂68%精甲霜灵·代森锰锌水分散粒剂。因此，烯酰吗啉可成为甲霜灵等苯酰氨类杀菌剂的理想替换药剂用于云南德宏州烟草黑胫病的防治。目前我国已经检测到烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的抗性菌株，证实了烯酰吗啉存在抗性风险[8]。因此应注意在烟草生产中要合理地进行有效药剂的轮换，不要长期单一施用烯酰吗啉类杀菌剂，以免对病原菌造成较大的选择压力，增加抗药性风险。

参考文献：

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[14]苏凯,桑维钧,张新强,等.贵州省烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性[J].植物保护,2013(1):154-158.

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Sensitivity of Phytophthora deliciosa to Deacylmorpholine in Dehong Prefecture,Yunnan Province

HE Xiao-hui1,XIAO Zhi-xin3,SONG Yu-chuan1,Hu Zhi-ming3, WANG Jie2,LI Yi-qiang2,WANG Feng-long2

(1.Yunnan Fragrance Tobacco Co.,Ltd.,Dehong,Yunnan 678400,China;2.Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao,Shandong 266101,China;3.Baoshan Tobacco Co., Yunnan Province,Baoshan,Yunnan 678000,China)

In order to clarify status quo of the sensitivity of tobacco black shank fungi to enoylmorpholine in the newly developed tobacco production area in Dehong Prefecture,Yunnan Province,the susceptibility was studied.68 strains of tobacco black shank were collected from 13 counties and cities of Dehong.The sensitivity and resistance level of the tobacco black shank strains to the alkenoylmorpholine were determined by the rate method.The results showed that the EC50of mycelia growth was 0.462 8~2.575 2 μg/mL,and the average EC50was 1.388 1 μg/mL,which belonged to the middle resistance level.The results also showed that the sensitivity of 68 mycelial growth to myoylmorpholine was in accordance with the normal distribution.EC50of the least sensitive strains were 5.56 times of the most sensitive ones.Deacylmorpholine was still highly active to tobacco black shank in Dehong,but should be used with other fungicides for reasonable rotation.

tobacco black shank pathogen;enolomorphine;drug resistance level

S435.72

A

2095-3704（2017）01-0008-06

10.3969/j.issn.2095-3704.2017.01.002

贺晓辉,肖志新,宋玉川,等.云南省德宏州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性[J].生物灾害科学,2017,40(1):8-13.

2017-01-21

云南省烟草公司科技支撑项目（2014YN37）

贺晓辉，农艺师，硕士，主要从事晾晒烟生产技术研究及推广工作，75350507@qq.com。