牦牛源鲍曼不动杆菌的分离及鉴定

刘 鑫，汤 承，2，岳 华，2*

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.国家民委青藏高原动物疫病防控创新团队，四川 成都 610041）

牦牛源鲍曼不动杆菌的分离及鉴定

刘 鑫1，汤 承1，2，岳 华1，2*

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.国家民委青藏高原动物疫病防控创新团队，四川 成都 610041）

本试验从患肺炎的牦牛细支气管中分离得到一株致病细菌“SWUN6759”，用PCR扩增其16S rRNA序列进行鉴定，并作同源性比对、系统进化分析，以及药物敏感及致病性检测。结果显示：SWUN6759为鲍曼不动杆菌，它与鲷源、鸡源、水蜡虫源、人源、牛源鲍曼不动杆菌的核苷酸序列的同源性均低于50%，说明SWUN6759具有种属特异性；耐药性结果显示其仅对多西环素、氧氟沙星、环丙沙星敏感，致病性试验结果显示其对小鼠具有较强的致病作用。

牦牛；鲍曼不动杆菌；16S rRNA；系统进化分析

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Ab）广泛分布于自然界，在水、土壤、乳和健康动物的皮肤、胃肠道、生殖道以及呼吸道中均存在，常引起脑膜炎、伤口感染、败血症等严重的医源性感染，通常认为Ab属于条件致病菌，易在重症监护病房流行[1-3]。Ab对大多数抗生素不敏感，治疗比较困难。近年来，由该菌引起畜禽发病的报道在逐渐增多，邹德颖等[4]从病死雏鸡中分离出Ab；钟世勋等[5]在某发病羊场分离到两株对小鼠有较强致病作用的Ab，其对多种抗菌药物具有耐药性。本研究在对牦牛肺炎病原学的调查中从牦牛肺支气管内分离出一株牦牛源Ab，鉴定报告如下：

1 材料与方法

1.1 病料及试验动物 有出血和实变的牦牛肺脏，采自甘孜州理塘县牦牛屠宰点；4～6周龄昆明系小鼠10只（22g±2g），购自四川大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 18种抗菌药物的药敏片（克林霉素、林可霉素、青霉素、万古霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、多西环素、链霉素、大观霉素、利福平、呋喃妥因、氨苄西林、头孢噻肟、氟苯尼考、氧氟沙星、环丙沙星、阿莫西林），普通肉汤、麦康凯培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、革兰氏染色液，均购自杭州微生物有限公司；DNA提取试剂盒购自上海阳光试剂有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs均购自TaKaRa公司；DNA Marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 细菌的分离培养 无菌切开肺脏，用接种环钩取细支气管内的分泌物，首先接种于普通肉汤培养基，37℃增菌培养24h后，培养物转种于TSA平板，37℃培养24h，观察菌落特征，挑选单个菌落抹片，革兰氏染色，观察细菌形态，并对分离菌株进行克隆纯化，命名为SWUN6759。

1.4 PCR鉴定 将SWUN6759接种于TSA，37℃培养12 h，用灭菌生理盐水洗下菌苔，用DNA提取试剂盒提取细菌总DNA，用16S rRNA基因通用引物[6]扩增其16S rRNA 1500bp片段。上游引物序列 F1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列R1：5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′（引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成），采用25μL反应体系：DNA模板2μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2 μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 16.3μL，同时设无模板对照。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像，产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.5 序列分析 用Blast对测序结果进行比对，将从GenBank数据库中获得的同源性较高的不同种属来源的鲍曼不动杆菌的序列作为参考序列，构建系统进化树，进行同源性分析。

1.6 药敏试验 采用纸片扩散法测定SWUN6759对18种抗菌药物的敏感性，按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的标准判断SWUN6759对受试药物的敏感程度[7]。

1.7 动物试验 将小鼠随机分为两组，每组5只。一组腹腔注射SWUN6759（2.2×108CFU/只），另一组腹腔注射等体积灭菌生理盐水作为健康对照，逐日观察各组小鼠的发病情况。对死亡小鼠进行剖检，并采集脾脏作为病料接种TSA，分离细菌，然后扩增其16S rRNA进行鉴定。

2 结果

2.1 SWUN6759的菌落及形态特征 SWUN6759在在37℃ TSA平板上长出湿润、光滑、半透明、边缘整齐、微隆起、中等大小的圆形菌落（图1）；革兰氏染色显示，分离菌为革兰氏阴性球杆菌，无芽孢（图2）。

2.2 PCR扩增结果 凝胶成像系统观察显示，PCR扩增产物在1 500 bp附近处出现一条明亮的特异性条带（图3），与预期大小相符。测序结果显示，SWUN6759的16S rRNA序列与GenBank中已发表的Ab 16S rRNA基因的同源性较高，达99%以上，证明SWUN6759为Ab。

图1 SWUN6759菌落形态

图2 SWUN6759革兰氏染色特性结果（10×100）

图3 SWUN6759 16S rRNA PCR产物的电泳图

2.3 SWUN6759的16SrRNA序列分析 同源性分析结果显示（图4）：SWUN6759与参考菌株KX242271（鱼源）、KT964444（鸡源）、JX966428（昆虫源）、JN668838（人源）的同源性均为44.1%，与JQ404488（牛源）的同源性为 44.0%，均低于 45%，说明SWUN6759具有种属特异性。系统发育树结果显示（图5）：SWUN6759与昆虫源Ab处于同一小分支。

2.4 SWUN6759对抗菌药物的敏感性 SWUN6759仅对多西环素、氧氟沙星、环丙沙星敏感，而对其余15种抗菌药物均具有耐药性（表1）。

2.5 SWUN6759的致病性 腹腔接种SWUN6759，48h内全部小鼠死亡，剖检可见肝脾肿大、瘀血，呈暗红色，肺充血，肠黏膜弥漫性出血，其余器官未见明显病变。从死亡小鼠的脾脏中回收到与感染菌形态特征一致的细菌，PCR扩增出鲍曼不动杆菌的rRNA。对照组小鼠健康状况良好，剖检未见病理变化。

图4 分离菌16S rRNA系统同源性比对

图5 分离菌16S rRNA基因系统进化树

表1 药敏试验结果 mm

3 结论

一般认为Ab毒力较低，只有在机体抵抗力下降或免疫功能受损时才引起感染，能引起人体各部位的感染，多见于医院内感染，其中以尿道和呼吸道感染率最高[8-9]。本研究通过病原学检查和16S rRNA基因测序从牦牛病变肺脏中分离出一株Ab，通过细菌毒力检验发现其具有较强的毒力，同时具有较为广泛的耐药性，表明其对牦牛养殖业具有较大威胁，应特别注意防范。系统发育分析结果表明：虽然SWUN6759与其他各株Ab参考菌株处于一个大分支上，与昆虫源处于一个小分支上，但是其与人源、牛源、鸡源、鱼源、昆虫源的同源性都低于45%，可见其具有种属特异性，可能是由于牦牛食用牧草时感染Ab所致，具体原因还需进一步研究。■

[1]Nwadike V U，Ojide C K，Kalu E I.Multidrug resistant acinetobacter infection and their antimicrobial susceptibility pattern in a Nigerian tertiary hospital ICU[J].African Journal of Infectious Diseases，2013，8（1）：14-18.

[2] Rastogi S，Gupta A，Narne R S，et al.Postcraniofacial trauma multidrug resistant Acinetobacter baumannii infection treated with intravenous colistin：A rare complication[J].Indian Journal of Dental Research Official Publication of Indian Society for Dental Research，2013，24（6）：759-761.

[3] 张齐武，黄晓文，牛淼，等.337株呼吸道鲍氏不动杆菌体外药敏结果分析 [J].中华医院感染学杂志，2011，21（22）：4826-4828.

[4] 邹德颖，刘东，郭兴，等.鲍曼不动杆菌雏鸡分离株CCGGD201101的分离、鉴定及致病性研究[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：178-181.

[5]钟世勋，李兵，王迪，等.山羊鲍曼不动杆菌分离鉴定和病原性研究[J].中国预防兽医学报，2014，36（8）：632-635.

[6]顾泽茂，柳阳，陈昌福，等.鲍曼不动杆菌斑点叉尾鮰株的分离与鉴定[J].华中农业大学学报，2010，29（4）：489-493.

[7]陈民钧.简介美国临床实验室标准化委员会（药敏标准）2004年新版[A]∥全国检验医学感染控制和病原监测学术研讨会论文集[C].2004.

[8] Zarrilli R，Pournaras S，Giannouli M，et al.Global evolution of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii，clonal lineages[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2013，41（1）：11-19.

[9]García-Quintanilla M，Pulido M R，López-Rojas R，etal.Emerging therapiesformultidrug resistant Acinetobacter baumannii[J].Trends in Microbiology，2013，21（3）：157-163.

Isolation and Identification of Acinetobacter Baumannii from Yak

Liu Xin1，Tang Cheng1，2，Yue Hua1，2*
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041；2.State Ethnic Affairs Commission to Create Innovation Team of Animal Disease Prevention and Control of the Qinghai Tibet Plateau，Sichuan Chengdu 610041，China）

One pathogenic bacteria strain named SWUN6759 was isolated from the lungs and bronchus of diseased yak.The 16S rRNA gene of the SWUN6759 strain was amplified by PCR-sequencing，the homology comparison and phylogenetic analysis were carried out.In addition，mice were inoculated with the culture of isolated bacteria to detect virulence，and susceptibility test was performed for screening effective antibiotics.The results indicated that the isolated strain was identified as an acinetobacter baumannii.The homology was 44.1%with porgy，gallus，mealybug，Homo sapiens and 44.0%with calves.It showed that theSWUN6759had speciesspecific.TheSWUN6759 wasonlysensitivetodoxycycline、ofloxacin、ciprofloxacin and multiresistant to most antibiotics and it had high pathogenicity to mice.

Yak；Acinetobacter baumannii；16S rRNA；Phylogenetic analysis

S858.234.43

B

1001-8964（2017）03-0028-03

2017-01-05

国家重点研发计划课题（2016YFD0500907）

刘鑫（1991-），男（土家族），湖北恩施人，硕士，研究方向：动物疫病防控技术。

*通讯作者：岳华（1963-），女,河南睢县人，博士，教授，主要从事动物病原分子生物学研究。