基于RGD多肽掺杂聚吡咯－铟锡氧化物的仿生微电极构建及用于细胞生物学行为的电化学阻抗谱检测*

李 远，肖文海，陈 静，廖 娟，刘北忠*

(1.重庆医科大学附属永川医院中心实验室，重庆402160;2.重庆市大足区中医院，重庆402360)

基于RGD多肽掺杂聚吡咯－铟锡氧化物的仿生微电极构建及用于细胞生物学行为的电化学阻抗谱检测*

李 远1，肖文海2，陈 静1，廖 娟1，刘北忠1*

(1.重庆医科大学附属永川医院中心实验室，重庆402160;2.重庆市大足区中医院，重庆402360)

电化学阻抗检测;RGD多肽;聚吡咯;铟锡氧化物;细胞增殖;细胞毒性

体外细胞行为学信息分析是细胞生物学机制研究及药物细胞毒性评价的重要手段。细胞阻抗生物传感器是一类以电化学阻抗谱为探测手段，分析传感电极表面培养/固定的活细胞自身或对外刺激响应行为学信息的新型生物传感器［1］。由于电化学阻抗谱技术具有无侵袭性、定性和定量相结合的优点，因此细胞阻抗生物传感器能够无标记、定量分析细胞粘附、增殖和凋亡等生物学行为［2－4］，从而广泛用于药物筛选［5］及细胞生理病理机制［6］等研究领域。在细胞阻抗生物传感器研究中，具有仿生功能的传感电极表面使细胞维持正常生理功能是确保传感器准确性的基础，因此构建具有良好仿生性能的传感电极是细胞阻抗传感器研究的关键。

当前，细胞阻抗传感器传感电极常采用生物相容性较差的惰性金属材质，如金［7］、铂［8］和玻碳电极［9］。采用新型生物相容性材料修饰是改善电极细胞生物相容性，促进细胞粘附和维持细胞活性的重要途径之一［10］。其中，导电聚合物聚吡咯由于具有本征导电、原位合成、表面性质可控、良好的生物相容和稳定性等优点，因此具有作为细胞电化学生物传感器电极修饰材料的潜力［11］。例如，Ding等在ITO电极表面修饰了碳纳米管掺杂聚吡咯纳米复合物，结果显示修饰的聚吡咯纳米复合物不但支持细胞粘附和增殖，而且通过电化学阻抗技术实现ECA－109细胞粘附和增殖检测［12］;Ateh等通过硫酸皮肤素掺杂聚吡咯修饰金电极以改善电极阻抗特征和生物相容性，以此实现了低浓度的角质细胞及细胞增殖行为的检测［13］。最近，我们将氧化石墨烯掺杂的聚吡咯膜通过电化学聚合方式修饰在ITO微电极表面显著改善了电极的电化学稳定性和生物相容性，并通过电化学阻抗谱技术解析了A549细胞增殖行为学信息［14］。

聚吡咯作为生物相容性电极修饰材料的另一个重要特性是掺杂剂选择。在吡咯电聚合过程中，掺杂剂带负电荷的阴离子作为带正电荷聚吡咯骨架的电荷平衡电子与聚吡咯相结合形成聚吡咯/掺杂剂复合物。掺杂剂除常见的化学分子外，一些具有活性的生物大分子也能作为聚吡咯掺杂剂，形成的聚吡咯/生物分子复合物能够与活细胞发生相互作用，进而调控细胞生物学行为［15－17］。例如，作为掺杂剂固定在聚吡咯表面的生物活性物质透明质酸能够维持活性达几天，并促进体内血管形成［15］。层粘连蛋白内的多肽功能片段CDPGYGSR作为掺杂剂制备的聚吡咯修饰Michigan神经记录电极能够促进神经母细胞瘤细胞在电极表面和周边生长［16］，不同的多肽功能片段CDPGYGSR和RNIAEIIKDIA作为掺杂剂制备的聚吡咯能够对培养在其表面的原代神经元细胞生物学行为产生不同的影响［17］。

另一个方面，在体内环境下，细胞与细胞外基质紧密结合，细胞外基质不但作为细胞生长的支架，而且调控细胞生物学行为。其中，细胞外基质中粘附性蛋白内包含的Arg-Gly-Asp(RGD)模体被证实是细胞能够识别的最小多肽序列，因此RGD模体在生物材料表面的固定修饰成为一种改善材料生物相容性，提高仿生性能的通用策略［18］。目前研究已报道通过共价键结合［19－20］和亲和性多肽序列连接器途径［21］实现RGD模体在PPy表面固定。然而，以含RGD模体多肽作为掺杂剂通过电化学共聚合途径制备生物活性聚吡咯复合膜的研究未见报道。为此，本研究以含RGD模体多肽分子作为吡咯电聚合的掺杂剂，通过更为简单的一步法电化学聚合方式在ITO微电极表面修饰PPy/RGD复合膜获得PPy/ RGD-ITO微电极。选择ITO玻璃作为基底电极是由于其优良的导电性和透光性，能够实现吡咯电聚合、电化学阻抗分析及细胞形态学观察。随后，对制备PPy/RGD复合膜的表面物理性能、组成成分及细胞生物相容性进行了系统表征。最后，以PPy/ RGD-ITO微电极作为传感电极，通过电化学阻抗谱技术对电极表面A549细胞增殖和天然抗肿瘤小分子重楼皂苷I的细胞毒性进行检测和分析。

1 材料与方法

1.1 ITO微电极加工及RGD/PPy复合膜电聚合和表征

ITO微电极加工采用课题组前期发展的感光干膜－ITO微电极工艺［22］，简要流程如下:将感光层厚度为35 μm的一层感光干膜(HQ－6100，长兴化学工业股份有限公司)通过覆膜机(100℃)压贴ITO导电玻璃(珠海凯为光电科技有限公司)导电面，透过掩膜胶片对感光干膜紫外光照射30 s，30℃条件下用1%碳酸钠溶液对感光干膜显影5 min，使未经紫外光照射区域的感光干膜溶解露出ITO微电极(电极直径为1.0 mm)，去离子水冲洗2次，60℃烘干，紫外照射60 s使感光胶完全固化。

电化学实验在CS315电化学工作站(武汉科思特仪器有限公司)上进行，采用三电极系统，在实验室自制的电化学小池装置中进行。电化学小池装置设计参考文献［22］，电化学小池装置含4个独立的电化学测量小池单元，每个小池单元直径为8 mm，体积为500 μL。三电极系统以位于测量小池单元底部的ITO微电极为工作电极，Ag/AgCl丝为参比电极(直径:0.5 mm，长度:10 mm)，铂丝为辅助电极(直径:1.0 mm，长度:10 mm)，电化学小池装置和三电极系统的照片图 1(a)所示。含 RGD模体的多肽序列GRGDSP由北京中科亚光生物科技有限公司合成。PPy/RGD复合膜在ITO微电极上聚合采用恒电位法。聚合溶液由去离子水配置(＞18 MΩ)，含0.1 mol/L吡咯单体和1.0 mg/mL GRGDSP多肽，聚合前抽真空5 min去除聚合溶液中溶解的氧气。聚合电压设置为0.7 V(vs.Ag/AgCl)。预实验发现，聚合电量设置为0.8 mC，能够在ITO微电极上形成均匀稳定的PPy/RGD复合膜，复合膜厚度通过理论计算约为209 nm［23］。作为对照，实验以1.0 mg/mL的有机分子聚4－苯乙烯磺酸钠(PSS，Sigma Aldrich)作为掺杂剂，在ITO微电极上聚合相同厚度的PSS/PPy膜。聚吡咯模拓扑形貌和粗糙度在原子力显微镜(Veeco MultimodeⅧ，布鲁克公司，瑞士)轻敲模式测量，通过Nanoscopy analysis软件(布鲁克公司，瑞士)分析，湿润性采用SDC－200光学接触角测量仪(晟鼎，中国)表征，组成成分通过Magna－IR 750傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)(尼高力，美国)表征。

1.2 细胞生物相容性研究

人肺癌上皮细胞株A549由重庆医科大学附属永川医院中心实验室常规保存培养。PPy/RGD复合膜的细胞相容性通过A549细胞粘附、铺展与增殖进行评价。为便于细胞培养实验，首先按照上述相同聚合参数在直径为6 mm的ITO电极上聚合相同厚度PPy/RGD复合膜(聚合电量为28.7 mC)，70%乙醇浸泡5 min消毒，无菌去离子水冲洗，干燥待用。将100 μL A549细胞悬液(5.0×104cells/mL)接种在含PPy/ RGD复合膜测量小池内，放入细胞培养箱(37℃，5% CO2)静置2 h，细胞在小池底部PPy/RGD膜的粘附形态通过倒置光学显微镜(IX71，奥林巴斯)观察，CCD相机拍照;A549细胞接种在PPy/RGD膜表面培养12 h待细胞完全铺展，PBS冲洗1次后用4%多聚甲醛溶液室温固定10 min，细胞铺展的三维形态学通过VK－150形状测量激光显微镜(基恩士，日本)观察;同时，细胞粘附力强度通过细胞冲洗实验量化。流程如下:A549细胞在PPy/RGD膜表面培养12 h，用2 μmol/L Calcein AM(Molecular probes公司，美国)对细胞荧光染色拍照，随后用新鲜培养液充分冲洗PPy/RGD膜表面去除未粘附和弱粘附细胞，拍照。细胞粘附强度通过计算冲洗前后相同大小视野下残留细胞数比值进行量化。细胞铺展和粘附实验以裸ITO电极和PSS/PPy作为对照。

A549细胞在PPy/RGD膜界面上的增殖行为通过WST－8实验评价。流程如下:100 μL A549细胞悬液(2.0×104cells/mL)分别接种在含PPy/RGD膜和PPy/PSS膜的测量小池内，细胞培养箱中培养24 h和48 h，随后加入10 μL WST－8分析液(碧云天生物技术公司)，轻摇混匀，37℃孵育1 h，分别取测量小池内溶液 100 μL，多功能酶标仪(Varioskan，Thermo Scientific)测定溶液在450 nm的吸光度，以650 nm作为参考波长，溶液吸光值与细胞数量和活性成正比关系。细胞增殖实验以传统96孔板聚苯乙烯表面作为对照。

1.3 细胞增殖和细胞毒性电化学阻抗测量分析

将100 μL的A549细胞悬液以浓度为2.0×104cells/mL加入含PPy/RGD-ITO微电极的测量小池内，室温下静置30 min使细胞均匀沉降到微电极表面后放入细胞培养箱中培养，培养2 h、24 h和48 h后将测量小池装置取出，PBS冲洗电极去掉死细胞及未粘附细胞。同时，将100 μL的A549细胞加载到含PPy/PSS-ITO微电极的测量小池作为实验对照，将空白细胞培养液加载含PPy/RGD-ITO微电极的测量小池作为空白对照。随后，在测量小池内加入500 μL 0.01 mol/L PBS作为支持电解质，将铂丝对电极和Ag/AgCl参比电极插入测量小池进行电化学阻抗谱测量。电化学阻抗谱测量在开路电压下对传感电极施加幅值为10 mV的正弦波交流检测信号，检测信号扫描频率范围为1 Hz～105Hz，阻抗谱测量数据用ZView 2.0软件建立等效电路后拟合分析。

为进行天然抗癌药物重楼皂苷I对A549细胞的细胞毒性量化分析，首先按上述相同方法将100 μL A549细胞(1.0×105cells/mL)接种在PPy/RGDITO微电极上培养24 h，随后将接种了细胞的微电极分为两组，以加入100 μL不同浓度重楼皂苷I溶液的电极作为实验组，加入不含重楼皂苷I的细胞培养液的电极作为对照组，孵育12 h后测量实验组和对照组电极系统的电化学阻抗谱，细胞毒性定义为:(1－Zt/Zc)×100%，其中Zt为实验组电极阻抗谱上阻抗改变最大值，Zc为对照组阻抗值。作为比较，重楼皂苷I对A549细胞细胞毒性通过细胞形态学变化和传统96孔板的WST－8实验进行测试，WST－8实验测量的细胞毒性定义为:(1－ODt/ODc) ×100%。其中，ODt为实验组溶液在450 nm的吸光度，而ODc为对照组溶液在450 nm的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 PPy/RGD-ITO微电极加工和表征

PPy/RGD复合膜在ITO微电极表面电聚合采用电化学恒电位技术，该技术一方面可通过设置聚合电量控制聚合PPy膜的厚度，另一方面可通过监测聚合过程中电流－时间曲线分析PPy聚合动力学过程［24］。PPy/RGD和PPy/PSS在+0.7 V(vs.Ag/ AgCl)聚合电压下监测的电流－时间曲线如图1(b)所示。结果显示，随着聚合时间延长，聚合电流值逐渐增大，该结果说明聚合的PPy膜具有优良的导电性，聚吡咯在电极表面不断沉积增大了电极活性面积［25］。此外，PPy/RGD聚合电流值小于PPy/PSS聚合电流值，其原因推测与RGD多肽分子的不良导电性和弱电解质特征有关。因此，在聚合相同电量情况下，PPy/RGD比PPy/PSS需要更长的聚合时间。在本研究中，由于聚合溶液只含 Py单体和RGD多肽，因此聚合溶液中呈负电荷的RGD分子作为吡咯电聚合过程中唯一掺杂剂平衡PPy骨架上的正电荷，从而形成PPy/RGD复合膜。如果聚合溶液只含Py单体，施加+0.7 V聚合电压则无电流产生，说明PPy未能发生电聚合，提示RGD多肽分子是Py电聚合必须的唯一掺杂剂并参与形成PPy/RGD复合膜。空白ITO微电极、PPy/RGD-ITO微电极和PPy/PSS-ITO微电极放大图像如图1(b)插图所示，说明在ITO微电极表面成功制备出PPy/ RGD复合物，且PPy/RGD膜与PPy/PSS膜在ITO微电极表面均匀分布，颜色呈灰褐色。

图1 PPy/RGD-ITO微电极制备

PPy/RGD复合膜的制备进一步通过FTIR进行确认。图2为PPy/PSS和PPy/RGD膜的FTIR光谱。其中，PPy/PSS的 FTIR光谱上 1 548 cm－1，1 458 cm－1及1 046 cm－1波数的吸收峰为PPy环上的C—C，C—N和C—H的伸缩振动吸收峰［26］。与PPy/PSS相比，PPy/RGD膜 FTIR上明显增加了1 290 cm－1吸收峰，该波数吸收峰对应了RGD多肽的酰胺Ⅱ的特征峰［27］，该结果提示RGD多肽分子成功地掺杂进PPy膜内形成PPy/RGD复合膜。

表面拓扑形貌、粗糙度和湿润性是生物材料重要参数，影响着生物材料的细胞生物相容性。图3为电聚合PPy表面AFM二维图像和三维图像。结果显示PPy/PSS和PPy/RGD膜由直径约为50 nm的粒子串联而成，呈结节状油菜花结构，与文献报道的电化学聚合PPy表面拓扑形貌结果相似［28］。

图2 PPy/PSS和PPy/RGD膜的FTIR光谱

根据AFM图像分析结果显示，PPy/PSS膜表面粗糙度Ra为(23.4±1.22)nm(n=3)，PPy/RGD膜表面粗糙度Ra为(5.24±0.8)nm(n=3)，说明两种PPy膜均具有低粗糙度(＜100 nm)表面，有利于粘附细胞的固定和增殖［29］。此外，在相同的电聚合条件下，PPy/RGD膜比PPy/PSS膜具有更紧凑和粗糙度更低的表面，其原因还不清楚，推测与RGD多肽空间结构、电荷分布及RGD多肽与聚吡咯骨架相互作用有关。PPy膜的湿润性通过采用5 μL去离子水的座滴法分析，结果显示PPy/RGD膜的静态接触角为(48.6±0.5)°(n=3)，略为高于PPy/PSS膜的静态接触角为(32.6±0.8)°(n=3)，但PPy/RGD膜仍呈现足够的亲水性能促进细胞粘度和增殖［30］。

图3 不同掺杂PPy膜AFM图像

2.2 PPy/RGD膜细胞生物相容性评价

贴壁细胞在体外培养环境下其增殖行为常分为3个阶段，即细胞在适宜基底表面发生粘附、铺展和增殖。因此，本研究以人肺癌上皮细胞株A549为模型，以细胞铺展、粘附与增殖行为对PPy/RGD复合物细胞生物相容性进行评价。图4(a)为A549细胞接种在PPy/RGD膜、PPy/PSS膜和裸ITO电极表面2 h后相差显微图。从该图可见，PPy/RGD膜和PPy/PSS膜表面大部分A549细胞完成粘附并伸出伪足开始铺展，而裸ITO电极上粘附细胞大部分保持圆形。此外，PPy/RGD膜和PPy/PSS膜间铺展的A549细胞比例无明显差异，说明电聚合的PPy膜可促进A549细胞粘附，为细胞下一步铺展增殖提供良好的生物界面。A549细胞接种在不同基底表面12 h后细胞铺展三维形态图和图4(b)，结果显示3种基底表面上A549细胞均呈铺展状态，且伸出伪足，提示3种基底表面均支持细胞铺展。但相比裸ITO和PPy/PSS膜基底表面细胞的相对圆形三维形态，PPy/RGD膜上细胞呈伸长三维铺展形态，提示PPy/RGD膜具有最好的细胞粘附铺展能力。进一步，A549细胞与基底表面的粘附强度通过细胞冲洗实验进行量化，不同基底表面冲洗后残留细胞荧光图如图4(c)所示。结果显示PPy/RGD膜上A549细胞残留率(88.2±5.6)(n=3)，高于PPy/ PSS膜上A549细胞残留率(72.6±8.4)(n=3)和裸ITO表面A549细胞残留率(48.6±12.8)(n=3)，说明PPy/RGD在电极表面的修饰可进一步改善细胞粘附固定能力。

图4 PPy膜生物相容性

A549细胞在不同基底的增殖活性通过WST－8实验进行分析。图5为培养在PPy/RGD膜、PPy/ PSS和聚苯乙烯表面24 h和48 h时A549细胞相对活性。结果显示培养在两类PPy膜上的细胞相对增殖率均高于聚苯乙烯基底，说明PPy膜表面有利于细胞增殖，该结果与上述细胞粘附和铺展实验结果吻合，同时与其他文献报道［11，31］的结果吻合。此外，PPy/RGD膜上A549细胞增殖率高于PPy/PSS膜，说明PPy/RGD膜具有最优的促进A549细胞增殖的能力。除此之外，我们实验发现PPy/RGD膜还支持人血管内皮细胞EA.hy926、人膀胱癌细胞株T24及人前列腺细胞株PC－3的增殖(实验数据未给出)，进一步说明制备的PPy/RGD复合膜的生物相容性具有细胞类型普适性。

图5 A549细胞相对增殖率

2.3 PPy/RGD-ITO微电极上A549细胞粘附增殖电化学阻抗检测和分析

细胞粘附增殖行为学信息电化学阻抗检测采用了类似电子细胞基底阻抗传感技术ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)［1］。在本研究中，我们以制备的具有良好仿生性能的PPy/RGD-ITO微电极代替传统ECIS技术使用的金微电极作为传感电极，对A549细胞的粘附和增殖行为学信息进行检测。图6(a)为PPy/RGD-ITO微电极上接种A549细胞0 h、2 h、24 h、48 h时电极系统典型的电化学阻抗谱复平面图。结果显示A549细胞的粘附与增殖导致传感电极系统阻抗谱高频区域形成半圆，且随着接种时间的增加高频区传荷过程控制的特征半圆直径增大。该结果说明A549细胞的粘附增殖导致电极界面上离子电荷转移过程速度减慢和电子转移阻抗增大，其原因与电极表面细胞质膜的电容特征和离子导通性有关［13］。同时，空白对照PPy/RGD-ITO微电极在培养液中孵育后未出现传荷控制特征半圆，如图6(b)所示，说明PPy/RGDITO微电极在培养液中具有良好的稳定性，同时提示图6(a)中半圆的形成和直径增大是由A549细胞粘附增殖引起。

图6 PPy/RGD-ITO微电极上A549细胞增殖行为的电化学阻抗谱检测

A549细胞的粘附增殖行为进一步采用等效电路模型进行量化分析。PPy/RGD-ITO微电极采用溶液电阻(Rs)和常相位元件(CPE)的串联电路进行拟合，该等效电路可对0 h时PPy/RGD-ITO微电极阻抗谱数据很好地拟合，拟合元件值如图6(c)所示。细胞等效电路则由一个RC并联电路和一个R元件串联组成［32］。因此，接种细胞后电极系统的等效电路模型由PPy/RGD-ITO微电极和细胞等效电路模型串联而成，如图6(c)所示。其中，R's解释为细胞－电极间隙电阻，Rcell解释为细胞－细胞间电阻，Ccell解释为细胞质膜的电容效应。采用非线性最小二乘法对电化学阻抗谱数据进行拟合得到接种不同时间点A549细胞等效电路各元件的拟合值变化曲线，如图6(d)所示。结果显示，随着A549细胞在PPy/RGD-ITO微电极表面粘附和增殖，Ccell值在2 h～24 h逐渐增大，随后稳定(24 h～48 h)在8.9 nF～9.3 nF，略高于A549细胞在PPy/PSS-ITO微电极表面的7.6 nF～8.8 nF。Ccell值变化与细胞粘附增殖过程中细胞厚度降低、铺展面积增大、细胞离子通道数量和开闭有关［33］。A549细胞在PPy/RGDITO微电极表面R`s值逐渐增大，在48h达到最大值312 Ω，提示A549细胞增殖过程中与电极表面间间隙缩小，细胞粘附强度不断增强［33］。同时，PPy/ RGD-ITO微电极表面R's值高于PPy/PSS-ITO微电极，提示A549细胞与PPy/RGD-ITO微电极间粘附强度高于A549细胞与PPy/PSS-ITO微电极，该结果与上述细胞冲洗实验结果相符。此外，A549细胞在PPy/RGD-ITO微电极和PPy/PSS-ITO微电极随孵育时间延长Rcell值逐渐增大，Rcell值持续增加说明细胞－细胞间的间隙逐渐缩小，细胞融合度增加［34］。值得注意的是，A549细胞在 PPy/RGDITO微电极的 Rcell值在24 h和48 h高于 PPy/ PSS-ITO微电极，说明A549细胞在PPy/RGD-ITO微电极表面细胞融合速度快于PPy/PSS-ITO微电极，该结果与前述WST－8细胞增殖实验吻合，也进一步提示本文发展的细胞粘附增殖行为学信息检测方法的合理性。

2.4 重楼皂苷I的A549细胞毒性电化学阻抗检测

重楼皂苷I是一种从百合科植物南重楼和北重楼根茎中萃取的含甾体皂苷的小分子单体，研究证实其对非小细胞肺癌具有显著的抗癌效应［35］。为验证本文发展的基于PPy/RGD-ITO微电极的细胞行为学信息检测方法，实验以PPy/RGD-ITO微电极作为传感器电极，利用电化学阻抗谱技术对重楼皂苷I的A549细胞毒性进行量化分析。图7(a)为不同浓度重楼皂苷I对PPy/RGD-ITO微电极表面培养的A549细胞处理12 h后电极系统典型的阻抗频率曲线。结果显示，随着重楼皂苷I浓度逐渐增加，电极系统的阻抗值逐渐减低，推测与重楼皂苷I诱导细胞凋亡，电极表面的A549细胞质膜收缩和细胞脱落有关。其中，在频率为3.5 kHz处，阻抗值变化最为明显，说明检测频率为3.5 kHz时传感电极对细胞凋亡响应灵敏度最高，因此可通过检测3.5 kHz频率对应的阻抗值变化实现对重楼皂苷I细胞毒性的定量分析。电化学阻抗检测结果通过传统WST－8比色法和显微镜形态学观察方法进行验证。重楼皂苷I浓度与细胞毒性和细胞形态学之间的关系分别如图7(b)和图7(c)所示，结果显示呈凋亡形态的A549细胞数量随重楼皂苷I浓度增加而增加，同时电化学阻抗技术检测结果与传统的WST－8比色分析结果趋势吻合。然而，两种方法检测结果间仍存在微小差异，其原因推测与细胞培养基底(PPy/RGDvs.聚苯乙烯)以及检测机制(形态学vs.线粒体脱氢酶活性)不同造成。因此，为了获得更可靠结果，需要严格设置实验对照组、平行组及质量控制。尽管如此，相比传统光学分析方法，本文发展的基于PPy/RGD-ITO微电极的电化学阻抗检测方法具有无侵袭性、低成本(不需要昂贵的设备和试剂)及高准确性(RSD＜5%vs.RSD＜10%)等优点。

图7 重楼皂苷I的A549细胞毒性电化学阻抗检测

3 结论

本研究以含RGD多肽序列作为掺杂剂，通过简单的电化学共聚合方式在ITO微电极表征可控沉积PPy/RGD复合物制备出PPy/RGD-ITO微电极。实验结果显示PPy/RGD复合膜具有良好的生物相容性及仿生性，能促进A549细胞铺展、粘附与增殖。在此基础上，以PPy/RGD-ITO微电极作为传感电极，通过电化学阻抗谱技术首先分析了A549细胞粘附增殖行为学信息，解析了细胞粘附与增殖过程中细胞质膜电容、细胞间融合度及细胞－电极结合度的变化信息。其次量化分析了重楼皂苷I的细胞毒性，且检测结果与形态学检测和传统的WST－8比色法结果相吻合。综上，本研究不但提出了将生物活性分子直接掺杂进聚吡咯构建具有生物活性的传感电极表面，而且发展的基于PPy/RGD-ITO微电极细胞行为学信息阻抗检测方法未来可作为一种体外细胞分析新工具，应用在药物筛选、细胞病理生理学机制及细胞－导电聚吡咯材料间相互作用等研究领域。

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李 远(1985－)，男，重庆医科大学，博士，主要研究方向为微流控芯片及细胞生物传感器，liyuan_1985999@163.com;

刘北忠(1970－)，男，重庆医科大学，教授，博士生导师，主要研究方向为生物医学微纳米技术与系统、肿瘤分子诊疗靶点筛选等，lbzemail@163.com。

Construction of a Biomimetic Microelectrode Based on RGD Peptide/Polypyrrole-Indium Tin Oxide for Detecting Cell Biology Behaviors by Electrochemical Impedance Spectroscopy*

LI Yuan1，XIAO Wenhai2，CHEN Jing1，LIAO Juan1，LIU Beizhong1*
(1.Central Laboratory of Yongchuan Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 402160，China; 2.DAZU Chinese Medical Hospital，Chongqing 402360，China)

For fabricating an indium tin oxide(ITO)microelectrode modified with RGD peptide doped polypyrrole (PPy/RGD-ITO)and using it as sensing electrode for detecting cell biology behaviors by electrochemical impedance spectroscopy.The ITO microelectrode was firstly fabricated by etching the insulating layer of photosensitive dry film with lithography technology.Then the PPy/RGD composite was deposited on the surface of the ITO microelectrode by electrochemical copolymerization using the peptide contained RGD motif as the sole dopant to form the PPy/ RGD-ITO microelectrode.The surface topology morphology，wettability and composition of the resulted PPy/RGD composite film were characterized by atomic force microscope(AFM)，contact angle measurement instrument and fourier transform infrared spectrometer(FTIR)respectively.The human lung cancer A549 cells spreading，adhesion and proliferation experiments were conducted to investigate the interaction between the PPy/RGD composite with cells.Used the PPy/RGD-ITO microelectrode as sensing electrode，A549 cells adhesion and proliferation，as well as the cytotoxicity of Polyphyllin I，a well-known natural anti-cancer molecule，were analyzed by electrochemical impedance spectroscopy.Resulted showed that the RGD molecule was doped into the PPy matrix successfully through the facile electrochemical copolymerization and the resulted PPy/RGD composite film has excellent surface physical properties.The RGD molecule doped into the PPy matrix retained its biology activity and promoted A549 cells spreading，adhesion and proliferation when compared with bare ITO electrode and poly(4-styrene sulfonate) (PSS)doped PPy film.Finally，as the morphological change of A549 cells on the surface of PPy/RGD-ITO microelectrode would change the impedance spectrum characteristics of the electrode system，the information about A549 cells during the process of adhesion and proliferation as well as the quantitative cytotoxicity of Polyphyllin I could be obtained by the electrochemical impedance technology.Therefore，the PPy/RGD film prepared by doping the RGD molecule into the PPy through the facile electrochemical copolymerization showed excellent biocompatibility.In future，the PPy/RGD film could be used as the coupling interface between electronic system and biological cell system and for researching the cellular bio-behaviors and drug screening.

electrochemical impedance detection;RGD peptide;polypyrrole;Indium tin oxide;cell proliferation; cytotoxicity

C:7230J

10.3969/j.issn.1004－1699.2017.02.002

TP212.3

A

1004－1699(2017)02－0174－10

项目来源:重庆市自然科学基金面上项目(cstc2012jjA10046);重庆市卫生局中医药科技项目(ZY20132132);重庆市永川区创新能力建设平台项目(Ycstc2014bf5001);重庆市大足区科技计划项目(DZKJ，2014ACC1084);重庆医科大学附属永川医院院级研究项目(YJZD201302，YJZQN201534)

2016－07－22 修改日期:2016－09－22

摘 要:构建一种基于RGD多肽分子掺杂聚吡咯膜修饰的铟锡氧化物微电极(PPy/RGD-ITO)，并以此作为传感电极实现细胞生物学行为的电化学阻抗谱检测。采用光刻技术蚀刻感光干膜绝缘层制备ITO微电极;以含RGD模体的多肽分子作为吡咯电聚合唯一的掺杂阴离子，通过电化学共聚合方式在ITO微电极表面沉积PPy/RGD复合膜形成PPy/RGD-ITO微电极;原子力显微镜(AFM)、接触角测量仪和傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)分别表征PPy/RGD复合膜的表面拓扑形貌、湿润性和组成成分;人肺癌细胞株A549铺展、粘附及增殖实验考察了PPy/RGD复合膜与细胞间的相互作用;以构建的PPy/RGD-ITO微电极作为传感电极，通过电化学阻抗谱技术对A549细胞粘附增殖行为及天然抗癌药物分子重楼皂苷I的细胞毒性进行了分析。结果显示，通过简单的电化学共聚合成功将RGD分子掺杂进PPy膜内，且PPy/RGD复合膜具有优异的表面物理性能;PPy基质膜内掺杂的RGD分子保留其生物活性，相比裸ITO电极和聚4－苯乙烯磺酸钠(PSS)掺杂的PPy膜，PPy/RGD复合膜能更好地促进A549细胞的铺展、粘附和增殖;由于PPy/RGD-ITO微电极表面A549细胞形态学变化可改变电极系统的阻抗谱特征，因此通过电化学阻抗谱技术可解析A549细胞粘附增殖行为学信息，同时可定量分析重楼皂苷I细胞毒性。因此，通过简单的电化学共聚合方法将生物活性RGD分子掺杂进PPy膜内制备出的PPy/RGD膜具有优良的生物相容性，可作为一种重要的仿生电极修饰材料用于构建电子系统和细胞生物学系统的耦合界面，未来可应用于细胞生物学行为及药物筛选研究。