难溶性植物蛋白与功能油脂的自组装复合物的制备及其消化吸收

陈伟鸿,肖俊勇,马方励,万江陵,盛小莉

(1.无限极(中国)有限公司,广东广州 510000;2.华中科技大学无限极现代制剂技术联合实验室,湖北武汉 430000;3.华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉 430000)

难溶性植物蛋白与功能油脂的自组装复合物的制备及其消化吸收

陈伟鸿1,肖俊勇1,马方励1,万江陵3,盛小莉2

(1.无限极(中国)有限公司,广东广州 510000;2.华中科技大学无限极现代制剂技术联合实验室,湖北武汉 430000;3.华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉 430000)

本研究以大米蛋白和核桃油为研究对象,采用自组装工艺制备出大米蛋白-核桃油复合物,并通过扫描电镜(SEM)来表征复合物的形成;采用奶粉分散性测定实验评价大米蛋白-核桃油复合物与原料冲调性的差异;采用蛋白质体外消化率实验及核桃油药动学实验评价大米蛋白-核桃油复合物与原料在吸收上的差异。实验结果表明:大米蛋白-核桃油的分散时间缩短49.50%;与原料相比较,大米蛋白-核桃油复合物的蛋白质体外消化率提升了8.49%、油酸生物利用度提高了70.86%、亚油酸生物利用度提高了63.01%。经过自组装工艺制备的大米蛋白-核桃油复合物冲调性能更好、成分吸收更好。

难溶性植物蛋白,大米蛋白,核桃油,自组装,生物利用度

植物蛋白和功能油脂是保健食品常用的两大类功能物质,但这两类功能物质实际应用过程中存在着不足:植物蛋白因溶解度低,在冲调过程中分散性差;而富含不饱和脂肪酸的功能油脂自身稳定性较差,也难以直接添加到植物蛋白中进行搭配。

大米蛋白是一种常见的植物蛋白,具有抗原性低、生物价高等优点,广泛应用于高蛋白低过敏婴儿配方米粉[1]。但大米蛋白存在溶解度差、分散性不好等[2]问题导致在冲调过程中出现结块现象。结块现象不仅会影响消费者的服用口感,也会影响胃肠道对大米蛋白的消化吸收。

核桃油含有高达90%以上的不饱和脂肪酸及多种生物活性物质[3],因具有降血脂、清除自由基、增强抗氧化、提高记忆力等功能特性而广泛用于保健食品中[4]。核桃油常温下为液态,且属于脂溶性物质,难以直接与其他水溶性物质复配成配方食品。

自组装是指在分子之间自发地形成有序结构单元的一种现象[5]。自组装现象在日常生活中也屡见不鲜,例如牛奶中的成分——蛋白质与脂肪组装在一起从而形成均匀稳定的牛奶溶液。近年来越来越多的制剂工作者将自组装技术应用在提升难溶性物质的水分散性上,难溶性蛋白质具有亲水性及亲脂性基团,在外力作用下蛋白与油脂亲脂性基团可充分结合,当蛋白的亲水性基团外露,将大大提升难溶性蛋白的水分散性,伴随着蛋白分散性的提升,服用后与胃肠道消化吸收的接触面积将显著提升,将有利于蛋白的吸收。

本研究仿照牛奶成分的构成,以大米蛋白、核桃油为研究对象,试图通过自组装技术开发出分散性好、易于吸收的难溶性植物蛋白-功能油脂固体饮料及适合其工业化生产的工艺路线。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大米蛋白 纯度42.3%，购自江西金农生物科技有限公司;核桃油 购自菏泽中禾健元生物科技有限公司;麦芽糊精 购自保龄宝生物股份有限公司;大豆卵磷脂 纯度97.9%,购自舒莱贸易(上海)有限公司;维生素E 购自浙江医药新昌制药厂;生理盐水 购自国药集团化学试剂有限公司;SD大鼠 购自湖北省实验动物研究中心,许可证号SCXK(鄂)2015-0018;胃蛋白酶生化试剂BR 购自国药集团化学试剂公司;胰蛋白酶生化试剂BR 购自国药集团化学试剂公司;浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、氢氧化钠、盐酸等 均为分析纯。

JM-L型胶体磨 温州市长宏轻工机械有限公司;LPG-150型离心喷雾干燥机 常州市优博干燥工程有限公司;SYH-100型三维运动混合机 常州市精铸干燥设备有限公司;ATN-300型全自动凯氏定氮仪 上海洪纪仪器设备有限公司;Agilent7890A型气相色谱仪 美国Agilent公司;Quanta-200型环境扫描电镜 荷兰FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大米蛋白-核桃油复合物的制备工艺 将25 kg麦芽糊精投入360 kg 60 ℃热水中搅拌溶解,然后加入60 kg大米蛋白和25 kg甘露醇,搅拌均匀,即得水相。60 ℃水浴搅拌条件下,将4.54 kg卵磷脂和25.8 g维生素E加入15.04 kg核桃油中搅拌溶解混匀,即得油相。60 ℃水浴搅拌条件下,向水相中加入油相,加入剩余15 kg水冲洗配料罐壁,继续搅拌10～15 min后,将物料导入胶体磨中进行2次剪切,最后进行喷雾干燥即得大米蛋白-核桃油复合物。

1.2.2 大米蛋白-核桃油复合物分散时间测定 称取大米蛋白、大米蛋白-核桃油复合物样品各5 g,溶于25 ℃、50 mL 去离子水中,经恒温磁力搅拌器以一定的转速搅拌,记录从搅拌开始到乳粉结块组织全部分散所需时间;重复实验3次,取其平均值,此值作为分散时间(dispersity time,DT)[6]。

1.2.3 大米蛋白-核桃油复合物形态观察 通过SEM可以观察自组装样品表面的结构,在粘有导电的胶性物质样品台上撒上一薄层样品,用吹风机除去多余样品,样品镀金后置于电子显微镜样品室中,选择合适的倍数进行观察和拍照。

1.2.4 蛋白质体外消化分析

1.2.4.1 蛋白质体外消化率实验 实验方法参照文献报导[7-8]但略有改动,具体操作如下。

a.消化液的配制：参照现行药典[9]规定配制人工胃液、人工肠液、磷酸盐缓冲盐溶液。

b.蛋白质体外消化率实验:准确称量大米蛋白、自组装样品(以所含大米蛋白量计)约0.5 g,分别置于250 mL三角瓶中,加入30 g人工胃液,将三角瓶置于摇床中,设定温度为37 ℃,振摇速度80 r/min,振荡3 h。然后再用NaOH调节pH为6.8,加入15 mL磷酸盐溶液,再加入15 mL人工肠液,在摇床中于温度为37 ℃,振摇速度80 r/min的条件下,振荡3 h。从三角瓶中取出溶液10 g,加入10%三氯乙酸溶液10 g进行沉淀、离心(4000 r/min,10 min),取上清液。用凯氏定氮法测定溶液中的氮含量。同时按上述实验步骤,测定空白试样中的含氮量。

1.2.4.2 蛋白质体外消化率计算及数据处理 蛋白质体外消化率的计算公式如下:

采用ANOVA(方差分析)进行实验组组间的显著性检验。当p<0.05时有显著性差异。本实验均进行3次平行实验,2次重复实验。

1.2.5 油脂生物利用度分析

1.2.5.1 油脂生物利用度实验方法 将10只SD大鼠随机分成两组进行口服灌胃给药(2 g/kg·d),一组给予大米蛋白-核桃油复合物样品,另一组给予大米蛋白-核桃油物理混合物(大米蛋白∶核桃油=3.99∶1);于给药前和给药后0.5、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12、20、24 h从大鼠眼眶取血,并将血样置于抹有肝素的离心管中,在低温离心机中进行离心(4000 r/min,10 min),取血浆并低温保存待用。

1.2.5.2 血样处理 脂肪酸提取[10]:取血浆100 μL,加入甲醇0.5 mL,正己烷1.0 mL,涡旋振荡,加1 mol/L磷酸0.1 mL,涡旋振荡均匀,离心(4000 r/min,5 min),取全部上清液,加入0.1 mol/L磷酸0.3 mL,涡旋振荡,离心(4000 r/min,1 min),取全部上层清液,氮吹仪吹干样品。

脂肪酸甲酯化:样品加入0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液0.6 mL,于60 ℃水浴20 min,加入三氟化硼-乙醚0.3 mL于60 ℃水浴2 min,冷却后加入十七烷酸甲酯的正己烷内标物溶液10 μL,浓度2.756 mg/mL。再加入正己烷0.45 mL萃取,加入与正己烷等体积的饱和生理盐水,涡旋振荡,静置分层,离心(4000 r/min,2 min),取全部上层清液,用氮吹仪吹干样品,加入正己烷定容至200 μL。

1.2.5.3 油脂检测方法 色谱柱为FFAP(30 m,0.25 mm i.d.,0.5 μm film thickness);载气为N2;进口压力25 psi;进样体积:2 μL;分流比:1∶10;升温程序:初始温度:210 ℃,保持8 min,以20 ℃/min升温至230 ℃,保持 5 min,总分析时间15 min;进样口温度:260 ℃;检测器温度:280 ℃。

1.2.5.4 数据处理与分析 将每个采集时间点的血浆中油酸和亚油酸的平均值除以0 h时血浆中油酸和亚油酸的平均值作为该点的药物浓度数据,采用DAS2.0药动学软件对数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 大米蛋白-核桃油复合物收率及成分分析

收集如“1.2.1”制备得到的大米蛋白-核桃油复合物,得到109 kg,收率为84.1%,其中蛋白质含量为36.6%,核桃油含量为15.5%。

2.2 大米蛋白-核桃油复合物形态分析

通过SEM可以观察自组装样品表面的结构,在粘有导电的胶性物质样品台上撒上一薄层样品,用吹风机除去多余样品,样品镀金后置于电子显微镜样品室中,选择合适的倍数进行观察和拍照,结果如图1。将大米蛋白-核桃油复合物样品加水分散后,用倒置显微镜观察其形态,结果如图2。

图1 自组装样品SEM图(400×)Fig.1 SEM image of self-assembled rice protein-walnut oil compound(400×)

图2 自组装样品分散形态图(200×)Fig.2 Scatter pattern of self-assembled rice protein-walnut oil compound(200×)

大米蛋白-核桃油复合物喷雾干燥的样品在SEM观察下,呈圆形颗粒状,但有些颗粒凹陷,分析可能原因是在喷雾干燥中,颗粒水分气化不均。将喷雾干燥的复合物样品复溶后再倒置显微镜下观察乳液形状,复合物样品复溶后乳滴较大,有块状不溶物。

2.3 大米蛋白-核桃油分散时间测定

分散时间是指样品在水中分散溶解的时间,能够较为客观的反映出不同样品间在冲调过程中分散性的差异。从表1可知,大米蛋白-核桃油复合物的分散时间(51.00±1.00)s比大米蛋白的分散时间(101.00±2.65) s缩短了49.50%,通过方差分析两组样品的分散时间具有显著性差异(p<0.05),说明经过自组装后的大米蛋白-核桃油复合物的分散性更好。

表1 分散性测定实验(n=3,X±SD)

注:*p<0.05,表示两组样品间数据有显著性差异；表2同。

2.4 蛋白质体外消化率

蛋白质消化率是指被人体吸收的蛋白质占总摄入蛋白质的比值,反映出蛋白质被消化酶分解、吸收的程度。蛋白质的体外消化过程能够在一定程度上反映蛋白质在人体内的消化过程,因此蛋白质体外消化率的差异能够间接的反映蛋白质被人体吸收的差异。从表2可知,大米蛋白-核桃油复合物的蛋白质体外消化率78.98%±1.32%比大米蛋白的蛋白质体外消化率72.80%±0.48%提高8.49%,通过方差分析两组样品的蛋白质体外消化率具有显著性差异(p<0.05),说明自组装后的样品更易于被消化酶分解。

蛋白质体外消化率实验说明大米蛋白-核桃油复合物更易于被人体吸收,其原因可能是:通过自组装后的大米蛋白-核桃油复合物在人工胃液及人工肠液中自发形成高度分散的纳米乳,能够与消化酶充分接触,进而被快速分解[11-12];大米蛋白原料在人工胃液及人工肠液中会聚集成团或形成沉淀,导致无法与消化酶充分接触,进而影响吸收。

表2 蛋白质体外消化率(n=3,X±SD)

2.5 油脂体内生物利用度分析

油酸及亚油酸是核桃油的主要组成成分,故选择油酸及亚油酸作为评价不同样品核桃油吸收效率的目标成分。图3、图4为油酸、亚油酸在血浆中的浓度-时间曲线图,表3、表4为油酸、亚油酸的药动学参数。

表3 油酸药动学参数

图3 油酸在血浆中浓度-时间曲线图(n=6,X±SEM)Fig.3 Concentration-time curve of oleic acid in plasma(n=6,X±SEM)

图4 亚油酸在血浆中浓度-时间曲图(n=6,X±SEM)Fig.4 Concentration-time curve of linoleic acid in plasma(n=6,X±SEM)

药动学参数大米蛋白-核桃油复合物大米蛋白-核桃油物理混合物AUC(0-t)(mg/L·h)7740.274748.45Cmax(mg/L)678.82423.75

自组装工艺获得的大米蛋白核桃油复合物比物理混合对油酸、亚油酸的药-时曲线下面积AUC明显增大。与物理混合样品组相比,自组装样品组油酸的吸收利用率提升了70.86%,亚油酸的吸收利用率提升了63.01%。统计学分析表明:自组装样品组与物理混合样品组在油酸(p<0.05)和亚油酸((p<0.05)吸收效率中有显著性差异,说明经过自组装工艺制备的大米蛋白核桃油可以促进核桃油的吸收。

油脂药动学研究说明大米蛋白和核桃油组装复合后能提升油脂的吸收率。其可能原因是油脂需在体内胆汁及消化酶的作用下形成乳糜微粒后经由淋巴系统进入血液循环[13],而经过自组装后的大米蛋白-核桃油复合物在胃肠道的蠕动下自发地形成高度分散的类似乳糜微粒结构的乳液,相较与大米蛋白-核桃油物理混合物更利于油脂在体内的消化吸收。

3 结论

3.1 仿照牛奶组成成分的植物蛋白-油脂自组装工艺操作简单,适合工业化生产。

3.2 自组装技术能够使液态油脂固体化,便于液态油脂与其他成分进行复配。

3.3 通过蛋白体外消化率实验、核桃油药动学实验证明:与原料相比,通过自组装后的大米蛋白-核桃油复合物的成分吸收效率均得到显著提升。

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Preparation,digestion and absorption of a self-assembled compound of insoluble vegetable protein and functional lipid

CHEN Wei-hong1,XIAO Jun-yong1,MA Fang-li1,WAN Jian-ling3,SHENG Xiao-li2

(1. Infinitus(China)Company Ltd.,Guangzhou 510000,China;2.Joint Laboratory for the Research of Modern Preparation Technology-Huazhong University of Science and Technology and Infinitus,Wuhan 430000,China;3.College of Life Science & Technology,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430000,China)

The study took rice protein and walnut oil as subjects to obtain a rice protein-walnut oil compound by self-assembly technology,which was confirmed by scanning electron microscopy(SEM). The difference in recombination ability between the rice protein-walnut oil compound and the raw materials was evaluated by milk powder dispersity determination test. The difference in absorbability between the rice protein-walnut oil compound and the raw materials was evaluated by protein external digestibility test and walnut oil pharmacokinetic test. The results indicated that when compared with the raw materials,rice protein-walnut oil compound had the dispersion time shortened by 49.50%,protein external digestibility increased by 8.49%,oleic acid bioavailability increased by 70.86%,and linoleic acid bioavailability increased by 63.01%. Self-assembled rice protein-walnut oil compound had better recombination ability and absorbability.

insoluble vegetable protein;rice protein;walnut oil;self-assembly;bioavailability

2016-08-29

陈伟鸿(1985-)，男，硕士，工程师，研究方向：中药新制剂研究，E-mail：ray.chen@infinitus-int.com。

*通讯作者:万江陵(1963-)，男，硕士研究生，副教授，研究方向：药物设计和药物纳米制剂的研究，E-mail：wanjl@hust.edu.cn。

新会区科技计划项目(2015001006)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0106-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.011