芽孢皮层肽聚糖水解物RP-HPLC法分析条件优化

杜文斌，杨建兴，师静，孙静，章中，*

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川750021；2.宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏银川750001；3.宁夏出入境检验检疫局综合技术中心，宁夏银川750002）

芽孢皮层肽聚糖水解物RP-HPLC法分析条件优化

杜文斌1，杨建兴2，师静3，孙静1，章中1，*

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川750021；2.宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏银川750001；3.宁夏出入境检验检疫局综合技术中心，宁夏银川750002）

通过试验确定RP-HPLC法分析芽孢皮层肽聚糖水解物的最佳条件如下：在Welch Ultimate AQ-C18色谱柱上，柱温为30℃，流速为1mL/min，检测波长为206 nm，洗脱时间为120min，以甲醇和0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH= 4.31）做流动相，在0min～5min时使用100%磷酸盐缓冲溶液，在5min～120min时流动相中的甲醇浓度从0梯度增加到30%。结果表明：用RP-HPLC法分析芽孢皮层肽聚糖水解物是可行的，为研究高压热处理下芽孢皮层肽聚糖支架水解机理，并进一步阐明高压热处理杀灭细菌芽孢的机理提供了研究方法支撑。

RP-HPLC；芽孢；皮层；肽聚糖；水解物

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌在环境胁迫条件下形成的一类微生物休眠体，是影响食品安全和食品保藏的重要原因，是食品杀菌的关键目标[1]。超高压是一种重要的新型食品杀菌技术，超高压耦合热处理能有效杀灭芽孢，高压热处理下芽孢皮层肽聚糖发生了水解[2]，这是其杀灭芽孢的重要原因，但该处理下芽孢皮层肽聚糖水解的机理尚不明确，而要阐明这一机理，首先必须确定和优化芽孢肽聚糖水解物的分析方法。

芽孢一般由胞外壁、芽孢衣、外膜、皮层、细胞壁、内膜和内核组成。肽聚糖是芽孢皮层的主要成分，在压力胁迫条件下发挥保护作用，能保持超高压条件下芽孢结构的完好。单独使用压力时，1 600MPa的超高压处理都不能杀死芽孢[3-4]。肽聚糖由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1，4糖苷键交替连接而成[5]，其四肽尾的氨基酸组成和肽桥因菌种而异[6]。本文使用RP-HPLC法对芽孢皮层肽聚糖水解物进行分析鉴定，为阐明高压热处理下芽孢皮层肽聚糖水解机理，进而为阐明高压热处理杀灭细菌芽孢的机理提供研究方法支撑。

RP-HPLC技术发展迅速[7-8]，其柱效高、使用寿命长、重现性好、灵敏度高，几乎对各种类型的有机化合物都有良好的选择性，并可用于梯度洗脱[9]。推测高压热处理下芽孢皮层肽聚糖水解物为糖胺、胞壁酸、糖肽和氨基酸等有机物，所以从理论上推测RP-HPLC法应能较好地分析芽孢皮层肽聚糖水解物，选择合适的检测条件对各种样品的分析效果非常重要，本文对RPHPLC法分析肽聚糖水解物的条件进行了优化研究。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

营养琼脂：北京奥博星生物技术有限公司；Tris（分析纯）：Sigma-Aldrich公司；尿素、三氯乙酸、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；十二烷基硫酸钠（分析纯）、甲醇（色谱纯）：Sigma公司；盐酸（分析纯）：天津市北联精细化学品开发有限公司；磷酸（分析纯）：西安化学试剂厂；二硫苏糖醇（分析纯）、胰蛋白酶、溶菌酶：北京博奥拓达科技有限公司；L-丙氨酸（分析纯）：上海瑞永生物科技有限公司；菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），编号As1.433。

1.2 仪器与设备

Agilent1100型HPLC色谱仪及数据处理平台：美国Agilent公司；色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18柱（250mm×4.6mm；5μm）：美国Welch公司；UV-2450型紫外分光光度计：日本岛津公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁仪器厂；KDC-2046型冷冻离心机：科大创新股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芽孢制备

菌种用营养琼脂培养基活化培养3代以上，接入试管斜面促芽孢生长培养基上划线培养。在37℃培养7 d后，用接种环和无菌去离子水将试管斜面上的芽孢洗涤收集到离心管中。然后用冷的无菌去离子水离心洗涤3次（离心条件：7 000 r/min、4℃、15min）。离心后将上清液和沉淀上部一起倒掉，纯化后的芽孢重悬在无菌去离子水中，浓度调整为1.5×108CFU/mL左右，放在4℃保存，一个月内使用。

1.3.2 芽孢皮层肽聚糖提取

所有提取步骤都在离心管内、在1mL的体积进行，在未指明的情况下，所有离心条件均为（13 000 r/min、3min）。芽孢悬浮液离心后再用芽孢衣脱除剂在37℃处理两次，每次60min（脱除剂组成为50mmol/L、pH= 8的Tris-Hcl缓冲液，8mol/L尿素，1%（重量/体积）的十二烷基硫酸钠、50mmol/L二硫苏糖醇）。脱除芽孢衣后芽孢用水洗涤5次。然后用5%的三氯乙酸在95℃处理6min以钝化皮层裂解酶，再用1mol/L、pH8的Tris-Hcl洗涤1次，用水洗涤5次。用胰蛋白酶（0.1mg/mL、溶于20mol/L、pH8的Tris-盐酸缓冲液和10mmol/L的氯化钙）在37℃下消化处理16 h，将大部分蛋白质除去，离心取沉淀。添加十二烷基硫酸钠到1%，然后将芽孢样品在100℃加热15min。离心后，取沉淀物用水清洗直到上清液中没有十二烷基硫酸钠（大约洗涤10次），最后所得沉淀物即为芽孢皮层肽聚糖[10-14]。

1.3.3 肽聚糖水解物制备

将溶菌酶溶于12.5mmol/L、pH=5.5的磷酸盐缓冲盐中，活力调整为2 000U。取1.3.2所得的芽孢皮层肽聚糖在37℃的溶菌酶溶液中酶解[15-16]24 h，离心，取上清液，微孔滤膜过滤，待用。

2 结果与讨论

2.1 波长的选择

用分光光度计在190 nm～400 nm波长对芽孢皮层肽聚糖水解物样品进行全波段扫描[17]，结果如图1。

图1 芽孢皮层肽聚糖水解物紫外吸收光谱图Fig.1 Theultravioletabsorption spectra of spore′s cortical peptidoglycan hydrolysate

由图1可知，样品溶液在195 nm处有最大吸收，鉴于RP-HPLC色谱仪紫外检测器最小检测波长为200 nm，初步选择202 nm作为检测波长。

在202 nm检测波长下，以甲醇和0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH=4.31）做流动相，在0min～5 min时使用100%磷酸盐缓冲溶液，在5min～120min时流动相中的甲醇浓度从0梯度增加到20%。结果如图2。

图2 芽孢肽聚糖水解物在202 nm检测波长的色谱图Fig.2 Chromatogram of spore′scorticalpeptidoglycan hydrolysateat detection wavelength 202 nm

由图2发现基线严重漂移，严重影响了分析效果。基线漂移可能是甲醇在该波长下吸收大造成的，为了解甲醇在不同波长下的吸收大小，随后在190 nm～400 nm波长对甲醇进行全波段扫描，结果如图3，甲醇在194 nm处有最大吸收。对比图1和图3，可发现随着检测波长增加，甲醇的吸收比肽聚糖水解物的吸收下降得快，因此为减少甲醇吸收造成的干扰，将波长增加到206 nm进行检测。

图3 甲醇溶液紫外吸收光谱图Fig.3 Theultravioletabsorption spectra ofmethanolsolution

2.2 流动相的优化

对于芽孢皮层肽聚糖水解物的RP-HPLC法分析，流动相关系重大，有机溶剂的种类和浓度决定流动相的极性，即洗脱能力[18]。流动相中添加甲醇，可以改善洗脱效果和峰形，通过梯度改变流动相中的甲醇浓度，各物质会随流动相依次洗脱出来。为选择最佳的甲醇浓度，在30min内将甲醇浓度从0梯度增加到30%进行肽聚糖水解物洗脱试验，结果见图4。

如图4所示：在206 nm下，随着甲醇浓度增加，其吸收干扰也增加，经综合考虑流动相的极性要求和甲醇的吸收情况，最终选择甲醇浓度在5min～120min内从0梯度增加到30%。

以甲醇和0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH=4.31）做流动相，在0 min～5 min时采用100%磷酸盐缓冲液，在5min～120min时甲醇浓度从0梯度增加到30%，对芽孢皮层肽聚糖水解物进行分析检测，结果如图5。

图4 在30m in内流动相中甲醇从0梯度增加到30%的色谱图Fig.4 Chromatogram when themethanol concentration increased gradually from 0 to 30%in 0m in-30m in

图5 调整检测波长和流动相后芽孢皮层肽聚糖水解物色谱图Fig.5 Chromatogram of spore′scorticalpeptidoglycan hydrolysateafter adjusting thedetection wavelength andmobile phase

由图5可知，流动相能将芽孢肽聚糖水解物洗脱开，且由甲醇造成的基线漂移较小，但问题是被检测物的出峰面积太小，各组分出峰不明显，因此进一步提高了芽孢肽聚糖水解物浓度后进行RP-HPLC分析试验，结果如图6。

图6 提高浓度后芽孢皮层肽聚糖水解物色谱图Fig.6 Chromatogram of spore′s corticalpep tidoglycan hydrolysateof increased concentration

如图6所示：各组分出峰效果良好，峰形尖锐，峰面对称，几乎无拖尾现象，基线较稳定，对肽聚糖水解物的分析效果良好。

在肽聚糖水解物的制备过程中，使用了溶菌酶试剂，为排除溶菌酶试剂中各成分对分析结果的干扰，在以上RP-HPLC分析条件下对溶菌酶溶液单独进行分析检测，结果如图7所示：溶菌酶溶液在此条件下基本不出峰。和图7对比可知：图6中所见的各个峰确为芽孢皮层肽聚糖水解物中的各种组分。

图7 溶菌酶溶液色谱图Fig.7 Chromatogram of lysozyme solution

3 结论

本文通过研究确定枯草芽孢杆菌芽孢皮层肽聚糖水解物的RP-HPLC法最佳分析条件为：设置Welch Ultimate AQ-C18色谱柱温为30℃，流速为1mL/min，洗脱时间为120min，检测波长为206 nm，以甲醇和0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=4.31）作流动相，在0～5min时采用100%磷酸盐缓冲液，在5min～120min时甲醇浓度从0梯度增加到30%。在该条件下对芽孢皮层肽聚糖水解物的分析效果良好，下一步可用质谱对肽聚糖水解物的各种组分做进一步定性分析。本文的研究成果为阐明高压热处理下芽孢皮层肽聚糖水解机理，进而阐明高压热处理杀灭细菌芽孢的机理提供了研究方法支撑。

[1]Zhang Z,Jiang B,Liao X,et al.Inactivation of Bacillus subtilis Spores by Combining High-pressure Thermal Sterilization and Ethanol[J].International Journal of Food Microbiology,2012,160 (2)：99-104

[2]章中,胡小松,廖小军,等.温压结合超高压处理对芽孢杀灭作用的研究进展[J].高压物理学报,2013,27(1)：147-152

[3]章中.热和化学因素辅助超高压对枯草杆菌芽孢灭活研究[D].北京：中国农业大学,2013

[4]章中,杨宏伟,胡济美,等.化学物质辅助超高压处理对枯草杆菌芽孢的作用[J].中国食品学报,2015,15(5)：47-53

[5]OllmerW,Blanot D,de pedro MA.Peptidoglycan structure and architecture[J].FEMSMicrobbiologyReviews,2008,32(2)：149-167

[6]Inamura S,Fukase K,Kusumoto S.Synthetic study ofpeptidoglycan partial structures.Synthesis of tetrasaccharide and octasaccharide fragments[J].Tetrahedron letters,2001,42(43)：7613-7616

[7]Ghari T,Kobarfard F,Mortazavi SA.Developmentof a simple RPHPLC-UV method for determination of azithromycin in bulk and pharmaceuticaldosage formsasan alternative to the USPmethod[J]. Iran JPharm Res,2013,12(S)：57-63

[8]Nakov N,Petkovska R,Acevska J,et al.Chemometric approach for optimization of HILIC method for simultaneous determination of imipenem and cilastatin sodium in powder for injection[J].JLiq Chromatogr Relat Technol,2014,37：447-460

[9]刘桂洋,毛香菊,陈晋阳.反相高效液相色谱的基本原理及其应用[J].宁波化工,2008(3)：22-25

[10]杨媛,潘道东,曾小群.嗜酸乳杆菌胞壁肽聚糖的提取及结构分析[J].中国食品学报,2014,14(5)：202-208

[11]盛琴.枯草芽孢杆菌的提取及对小鼠免疫功能的影响[D].四川：四川农业大学,2011

[12]刘朝,乔建军,朱宏吉.乳酸杆菌肽聚糖的研究进展[J].微生物学通报,2016,43(1)：188-197

[13]付艳茹,靳烨.完整肽聚糖提取工艺的研究[J].中国乳品工业, 2009,37(4)：12-15

[14]Popham,D L.Specialized peptidoglycan of the bacterial endospore：the innerwall of the lockbox[J].Cellular and Molecular Life Sciences,2002,59：426-433

[15]符莉芳,宋志芳.溶菌酶的研究进展[J].浙江预防医学,2008,20 (4)：56-59

[16]王丹丹,郭淑元.芽孢杆菌肽聚糖水解酶功能的研究进展[J].生物技术通报,2015,31(2)：45-52

[17]高海燕,廖小军,王善广,等.反相高效液相色谱法测定果汁中11种有机酸条件的优化[J].分析化学研究简报,2004,32(12)：1645-1648

[18]全红娜,金松子,雷勇盛,等.反相高效液相色谱中流动相选择与优化的研究进展[J].现代药物与临床,2014,29(10)：1190-1194

Optim ization of RP-PHLC Analysis Conditions for Spore's Cortical Peptidoglycan Hydrolysate

DUWen-bin1，YANG Jian-xing2，SHIJing3，SUN Jing1，ZHANGZhong1，*
（1.CollegeofAgriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.Ningxia Food Inspection Center，Yinchuan 750001，Ningxia，China；3.General Technology CenterofNingxia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yinchuan 750002，Ningxia，China）

By experiment，the optimal RP-HPLC conditions for analyzing spore's cortical peptidoglycan hydrolysate were as follows：on Welch Ultimate AQ-C18 chromatographic column，column temperature 30℃，floWspeed 1mL/min，detection wavelength 206 nm，elution time 120min，withmethanoland 0.05mol/L PBS（pH=4.31）asmobile phase，in 0min-5min 100%PBSwasused，in 5min-120min themethanol concentration increased gradually from 0 to 30%.The result indicated that itwas feasible to use RP-HPLC foranalyzing spore's cortical peptidoglycan hydrolysate，which provided researchmethod support for studying the hydrolysis principle of spore's cortical peptidoglycan under HPTS（High Pressure Thermal Sterilization）treatment，and further for clarifying the principleofspore inactivation by HPTS.

RP-HPLC；spores；cortex；peptidoglycan；hydrolysate

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.023

2016-07-08

国家自然科学基金项目（31460410）

杜文斌（1991—），男（汉），硕士研究生，研究方向：新型食品杀菌技术、仪器分析。

*通信作者：章中（1977—），男（汉），副教授，博士。