新疆野苹果基因组提取优化及模板浓度对ISSR-PCR影响

张云秀，杨美玲，于玮玮，李芳，刘彬，龙鸿，阎国荣，通信作者



新疆野苹果基因组提取优化及模板浓度对ISSR-PCR影响

张云秀1，杨美玲2，于玮玮1，李芳1，刘彬1，龙鸿1，阎国荣1，通信作者

（1. 天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2. 南开大学生命科学学院，天津300071）

以新疆野苹果干燥叶片为材料，比较分析了CTAB法和4种改良CTAB法提取基因组DNA效果，及ISSR-PCR扩增所需最佳模板浓度。结果表明：5种方法提取的DNA在纯度和量上有很大差别，研磨时加入PVP，可有效去除多酚物质；第一次提取上清液中加入1/10体积CTAB裂解液（0.7 mol/L NaCl、10%CTAB），可以有效去除多糖；异丙醇沉淀时加入1/9体积的乙酸钠，可加速得到白色沉淀。新疆野苹果ISSR扩增体系研究中，发现DNA模板浓度处于400～1 000 ng/μL时，ISSR-PCR扩增结果最佳。DNA提取优化及模板浓度优化为后续的分子生物学研究提供理论依据。

新疆野苹果；DNA提取；模板浓度；优化

新疆野苹果 [（Ledeb）Roem]，也称塞威氏苹果、天山野果等，不仅是我国珍贵的第三纪残遗物种[1]，也是世界苹果基因库的重要组成部分。它属于蔷薇科苹果属植物，落叶乔木，不同居群的花期在4月中旬到5月中旬，果实较栽培苹果小，酸度较高，主要集中在中亚的哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦和我国的新疆西部山区。早期对新疆野苹果的研究，主要集中在起源进化、地理分布、系统分类[2-5]等方面。遗传多样性方面的研究，分子标记技术的发展给种质资源的筛选、鉴定和辅助育种等方面提供了新的方法和手段，基因组DNA的提取是分子标记技术的基础。新疆野苹果是多年生木本植物，叶片中含有大量的多糖、蛋白质及多酚类物质，而CTAB是一种阳离子去污剂[6-7]，既能裂解细胞，又能有效地沉淀次生代谢物，尤其是多糖。本文以CTAB法为基础进行改良，确定新疆野苹果DNA提取的最适宜方法，确定ISSR分子标记的最佳模板浓度，为后续分子生物学方面的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆野苹果的叶片分别采自于新疆伊犁地区的新源、巩留、那拉提以及塔城地区的额敏、托里。选取树枝上无病虫害的新鲜叶片，擦拭干净后分别放于硅胶干燥袋中，并做好标记，保存备用，材料详见表1。

表1 试验材料

1.2 药品及仪器

药品：ISSR引物、dNTP、100 bp Marker，购自上海Sangon；MgCl2、10×Buffer、DNA聚合酶， 购自上海Promaga。

仪器：Bio-Rad电泳仪；Eppendorf PCR仪； BECKMENUV-640型紫外分光光度计；Gensnap凝胶成像仪；Eppendorf离心机。

1.3 方法

1.3.1 叶片DNA的提取

A：CTAB法，（1）取0.15 g干燥叶片，在液氮中迅速研磨成粉。（2）迅速转移至预热30 min的CTAB裂解液中，剧烈摇匀，65 ℃保温30 min（每隔5 min摇匀一次），保温后12 000 r/min，离心10 min。（3）取上清，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻颠倒摇匀100次以上，12 000 r/min，离心10 min。（4）重复步骤3两次。（5）取上清，加入等体积的-20 ℃预冷异丙醇沉淀，轻轻颠倒摇匀至沉淀出现。若不出现沉淀则在-20 ℃下沉淀2 h。（6）4 000 r/min，离心10 min。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀2次，室温晾干。（7）40 μL 0.1×TE（pH 8.0）缓冲液溶解。

B：在步骤（1）中，研磨时加入PVP。

C：在步骤（3）中，第一次上清液中加入1/10体积CTAB裂解液（0.7 mol/L NaCl、10%CTAB）。

D：在步骤（5）中，异丙醇沉淀时加入1/9体积的乙酸钠（溶液浓度）。

E：步骤（1）中，研磨时加入PVP；步骤（3）中，上清液中加入1/10体积CTAB裂解液；步骤（5）中，加入1/9体积的乙酸钠沉淀。

1.3.2 DNA检测

用紫外分光光度计测定DNA样品在230、260、280 nm波长处的光吸收值，根据260/230、260/280比值估算DNA纯度，根据260 nm处的光吸收值计算DNA浓度。在0.5×TBE缓冲液条件下，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电压5 V，溴化乙锭染色后，在凝胶成像系统上观察，并拍照。

1.3.3 不同模板浓度 ISSR-PCR扩增

以多态性高、稳定性好的随机引物ISSR03：AGAGTTGGTAGCTCTTGATC进行ISSR-PCR，确定新疆野苹果ISSR最佳模板浓度。

反应体系：总体积20 μL，Mg2+2.5 mmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，引物0.25 mmol/L，模板100～2 000 ng，DNA聚合酶1 U。

扩增程序：94 ℃预变性4 min，（94 ℃变性30 s，53.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min）40个循环，然后72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。（退火温度比计算温度高2 ℃）扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2 .1 新疆野苹果基因组提取优化结果

苹果叶片含有较多的次生代谢产物，因此新疆野苹果基因组DNA提取要比普通作物困难。本试验在CTAB法基础上进一步改善，通过5种方法进行比较，设法减少多糖、酚类等物质干扰，基因组DNA提取结果见表2。

表2 新疆野苹果基因组DNA性状

选取不同居群的7个新疆野苹果样品进行A～E 5种DNA提取方法试验， TE缓冲液溶解后，分别取1 μL DNA样品，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，5种方法检测结果分别如图1、2、3、4、5所示。由电泳检测图可见，图5和图4都有DNA条带，但图5条带更清晰，且加样孔处无蛋白残留。图3条带不完全，有杂质存留。图1和图2结果最差，几乎没有条带。

图1 A法提取基因组DNA凝胶电泳检测

图2 B法提取基因组DNA凝胶电泳检测

图3 C法提取基因组DNA凝胶电泳检测

图5 E法提取基因组DNA凝胶电泳检测

2.2 DNA吸光度值检测结果

260/280及260/230比值是DNA样品质量的检测标准[8-9]，由表3可以看出，CTAB法（A法）提取的DNA260/280远小于1.80，说明抽提过程中有蛋白质或者酚类物质的残存，DNA受污染。以CTAB法为基础，加PVP研磨（B法）及CTAB裂解液（C法）提取的DNA260/280介于1.60～1.70之间，说明也受到蛋白及酚类物质污染，但与A法相比，污染程度降低；乙酸钠沉淀（D法）260/280大于1.98，说明蛋白及酚类物质污染较少，但有RNA残存。E法提取的DNA260/280值介于1.80～1.90之间，说明DNA较纯，几乎不受蛋白等物质影响。A、B、C三种方法吸光度260/230值均小于2.00，说明有糖等碳水化合物的污染，但C＞B＞A，污染程度呈下降趋势。D和E法大于2.00，说明DNA较纯，受其他物质干扰较小。

表3 DNA吸光度值检测结果

2.3 ISSR扩增最佳浓度模板筛选

模板浓度是影响ISSR-PCR结果的关键因素之一，选取1～5号样品，通过改良的CTAB法E法提取基因组DNA，首先用30 μL TE将其溶解，然后取1 μL将5个样品均稀释成6个浓度梯度，然后分别以此为模板，进行ISSR分析，研究不同模板浓度对ISSR-PCR的影响。结果见表4。

表4 不同模板浓度ISSR-PCR扩增结果

注：++表示扩增效率高；+表示有扩增产物；-表示无扩增产物

表4表明：DNA模板浓度为1 857.2 ng/μL和197.5 ng/μL时，均扩增不出条带，浓度为1 436.7 ng/μL可扩增出条带，但条带较少，不清晰。439.8～1 003.5 ng/μL的模板浓度扩增结果基本相同，可扩增出较多、较清晰的条带。DNA模板浓度为1 857.2、1 436.7、1 003.5 ng/μL时的ISSR-PCR扩增电泳检测结果分别见图7、8、9。

图7 DNA模板浓度1 857.2 ng/μL的ISSR-PCR电泳检测

图8 DNA模板浓度1 436.2 ng/μL的ISSR-PCR电泳检测

图9 DNA模板浓度1 003.5 ng/μL的ISSR-PCR电泳检测

3 结论与讨论

3.1 基因组DNA提取方法比较

A法提取的DNA沉淀体积大，呈黄色，杂质较多，加入TE缓冲液溶解后的液体呈黏稠状，是因为多糖与DNA一同沉淀，形成黏稠的胶状物，包裹DNA，这些多糖会改变PCR缓冲液pH值或抑制酶活性，导致PCR扩增失败[10]。B法在研磨期间加入聚乙烯吡咯烷酮，提取的DNA沉淀较A颜色变浅，是由于 PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少酚的污染。C法在提取过程中二次加入裂解液进行裂解，使得细胞核裂解更彻底，提高DNA析出量。pH 4.8的3 mol/L乙酸钠可以降低反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而染色体DNA或质粒复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。所以，D法中加入乙酸钠可以促进DNA沉淀。E法是A、B、C、D的结合，通过加入PVP而减少多酚的污染，二次裂解降去除多糖，提高DNA含量，乙酸钠促进DNA沉淀，得到较纯的DNA，为ISSR-PCR提供高质量模板。

3.2 DNA模板浓度对ISSR-PCR扩增的影响

ISSR 标记具有多态性高、重复性好、呈共显性等特点，已经在作物的遗传多样性研究中得到了广泛应用[11-13]。建立稳定的ISSR-PCR 反应体系是ISSR分子标记技术应用的基础。模板DNA 浓度与纯度是决定 PCR 成败的重要环节之一，模板浓度过低则PCR 产物量太少，而模板量过多则会导致非特异性扩增产物量增加。本试验表明，新疆野苹果20 μL体系ISSR-PCR扩增中模板浓度在400～1 000 ng/μL时，扩增结果最佳。这为进一步研究不同居群以及居群间不同单株的遗传多样性以及亲缘关系都提供了理论基础。

[1] 张新时．伊犁野果林的生态地理特征和群落学问题[J]. 植物学报，1973，15（2）：239-253.

[2] Ponomarenko V V. The polymorphylism and the characteristics ofspecies in Russian[D]. Russian：Vavilov Institute of Plant Industry，1991.

[3] 冯涛，张艳敏，陈学森. 新疆野苹果居群年龄结构及郁闭度研究[J]. 果树学报，2007，24（5）：571-573.

[4] 阎国荣. 主分量分析法在新疆野苹果与数种栽培品种亲缘关系研究中的应用[J]. 新疆环境保护，1997，19（1）：41-45.

[5] Stephen A H，Julian P R，Barrie E J. Genetic clues to the origin of the apple[J].，2002，18：426-430.

[6] 王金发，何炎明．细胞生物学实验教程[M]. 北京：科学出版社，2004.

[7] 翟朝阳. 生物分子实验教材[M]. 成都：四川大学出版社，2004.

[8] 刘欣，祝长青，王毅谦，等. 大豆转基因检测中DNA提取方法的比较研究[J]. 食品科学，2013，34（4）：199-203.

[9] 周海兰，李绍鹏，李卫亮，等. 油梨基因组DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选[J]. 生物技术通报，2016，32（4）：143-150.

[10] 邹喻萍，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记[M]. 北京：科学出版社，2001.

[11] 铁双贵，郑用琏，尹艳. 玉米新合成群体8种等位酶17个位点的遗传多样性及与数量性状相关性研究[J]. 作物学报，1999，25（6）：759-765.

[12] 程春明，石云素，宋燕春，等．ISSR分子标记技术在分析玉米自交系遗传关系研究中的适用性[J]. 植物遗传资源学报，2005，6（2）：172-177.

[13] 杨若林，孔俊，吴鑫，等. ISSR 标记在辣椒资源遗传多态性分析中的初步应用[J]. 上海大学学报（自然科学版），2005，11（4）：235-237.

责任编辑：杨霞

Optimization of Genome Extraction and Effect of Template Concentration on ISSR-PCR in

ZHANG Yun-xiu1, YANG Mei-ling2, YU Wei-wei1, LI Fang1, LIU Bin1, LONG Hong1, YAN Guo-rong1，Corresponding Author

（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. College of Life Sciences，Nankai University, Tianjin 300071, China）

Asdried leaves for materials, compared and analyzedthe result of extracting genomic DNA with the CTAB method and four kinds of modified CTAB method, besides,to determine the best template concentration for ISSR- PCR. Results showed that the purity and quantity of DNA with five methods has much difference, grinding with PVP can effectively remove polyphenols; adding1/10 volume CTAB cracking in the supernatant fluid （0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB） can effectively remove polysaccharide; isopropyl alcohol precipitating with 1/9 volume sodium acetate can get white precipitation quickly . As for theISSR amplification systemstudy, found that ISSR-PCR amplified result is best with DNA template concentration in 400 ~ 1 000 ng/μL. DNA extraction and the concentration of template optimization provide theoretical basis for subsequent molecular biology research.

; DNA extraction; template concentration; optimization

1008-5394（2017）01-0015-04

Q946-33

A

2016-05-13

新疆维吾尔自治区财政林业科技专项项目“新疆野苹果种质资源收集与评价”（无编号）

张云秀（1991-），女，山东章丘人，硕士在读，主要从事新疆野苹果种质资源利用与保护研究。E-mail：1058496051@qq.com。

阎国荣（1957-），男，甘肃敦煌人，教授，博士，主要从事果树种质资源与生理生态方向研究。E-mail：yanguorong@eyou.com。