超高效液相色谱—三重四极杆质谱法测定大鼠海马和大脑皮层中生物胺类及氨基酸类神经化学物质

黄鑫 李帅坪 张勇 刘淑莹

摘要 建立了超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测大鼠海马和大脑皮层中生物胺类及氨基酸类神经化学物质含量的方法。选用Hypercarb（100mm×2.1mm，5μm）色谱柱，以0.1%甲酸甲醇为流动相，梯度洗脱。电喷雾离子源（ESI）在正离子模式下，选择多反应监测模式（MRM）扫描，对检测的6种生物胺类和11种氨基酸类神经化学物质分别选择一个定性离子对和一个定量离子对。测定Wistar大鼠海马和大脑皮层中6种生物胺类和11种氨基酸类神经化学物质的含量，对比两种不同脑组织样品前处理方法对神经化学物质含量测定结果的影响。17种神经化学物质在10min内即可完成同时测定，检测方法线性关系良好，日内和日间精密度、加标回收率和重复性满足分析要求。本方法准确、灵敏度高、专属性强、重复性好，适用于脑组织中生物胺类及氨基酸类神经化学物质的含量测定，可为生物胺类及氨基酸类神经化学物质提供有效的样品前处理方法和检测手段。

关键词超高效液相色谱三重四极杆质谱法；生物胺类神经化学物质；氨基酸类神经化学物质；脑组织

1引言

神经递质（Neurotransmitter）在神经化学传递中是充当“信使”的特定化学物质。脑内神经递质分为4类，即生物胺类、氨基酸类、肽类和其它类。随着神经生物学的发展，陆续在神经系统中发现了大量具有神经活性的物质。生物胺类递质是最先发现的一类神经递质，包括多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、5羟色胺（5HT）。酪氨酸（Tyr）是DA、NE和E的前体，色氨酸（Try）是5HT的前体，在多种应激情况下，维持正常的生物胺类递质代谢和脑功能的发挥。5羟吲哚乙酸（5HIAA）是5HT代谢的产物，5HIAA的变化也可间接反应5HT的变化。褪黑激素（Melatonin）主要是由哺乳动物和人类的松果体产生的一种胺类激素，5HT在N乙酰基转移酶的作用下，转化成N乙酰基5羟色胺，最后合成Melatonin。生物胺类神经化学物质在人体和哺乳动物的中枢神经、心血管和内分泌等组织系统中发挥着广泛的调节作用，参与情绪、情感、应激行为和睡眠觉醒等多种生理过程[1＼]，含量的变化与人类多种疾病密切相关，是诊断阿尔茨海默症、唐氏综合征、抑郁症和帕金森等疾病的重要依据[2～5＼]。组胺（Histamine）是一种活性胺化合物，作为身体内的一种化学传导物质，可以影响许多细胞的反应，中枢组胺能神经系统影响脑部神经传导，参与睡眠、荷尔蒙的分泌、体温调节、食欲与记忆形成等功能[6＼]。乙酰胆碱（Ach）是中樞胆碱能系统中重要的神经递质之一，其主要功能是维持意识的清醒，在学习记忆中起重要作用。被确定为神经递质的氨基酸有γ氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、牛磺酸（Tau）和丝氨酸（Ser）[7＼]。谷氨酰胺（Gln）作为大脑的一种能量来源，具有保护大脑的功能，能改善心情、增强智力，并有益于长期与短期记忆[8，9＼]。氨基酸类神经化学物质对于调节机体生理活动具有重要作用，其含量及比例的变化与多种中枢神经系统疾病的发生及发展密切相关[2～5，10＼]。因此，生物样品中生物胺类及氨基酸类神经化学物质的准确测定对于某些疾病的筛查、诊断和治疗以及药物在体内的作用具有重要意义。

神经化学物质在生物样品中的含量很低，而生物样品本身基体复杂，内源性干扰物质较多，因此高效快速的样品前处理方法和高灵敏度的检测手段是开展神经化学物质研究的难点。采用高效液相色谱分离，再以紫外、荧光、电化学和质谱方法检测，是测定神经化学物质较常用的方法[11～21＼]。由于氨基酸无紫外吸收，用液相色谱法进行检测时需对氨基酸进行柱前或柱后衍生[16～20＼]。生物胺类神经化学物质为强极性化合物，在反相色谱柱上保留极弱，对荧光和质谱的响应信号较弱，可通过衍生化处理改善色谱保留行为和离子化效率[16～19，21＼]。但衍生操作步骤繁琐，耗时耗力，而且衍生程度也难以保证，JP衍生反应还可能生成非目标衍生物，这些对神经化学物质的准确测定都会产生影响。目前，HPLCMS/MS兼具分离能力强和灵敏度高的优势，已逐渐发展成为复杂生物体系中痕量生物活性物质分析的强有力手段[22～26＼]。

本研究采用超高效液相色谱三重四极杆质谱法建立了对大鼠海马和大脑皮层中生物胺类及氨基酸类共17种神经化学物质同时快速分析的方法。本方法的选择性和重现性好，灵敏度高，并且无需对样品进行衍生化和固相萃取等复杂的前处理，简化了分析步骤，提高了分析效率。对比了两种不同脑组织样品前处理方法对神经化学物质含量测定结果的影响。本方法可应用于脑组织中生物胺类及氨基酸类神经化学物质的分析测定，为临床检测提供了有效的样品前处理方法和检测手段。

2实验部分

2.1仪器与试剂

DionexUltimate3000超高效液相色谱仪TSQEndura三重四极杆质谱仪，Hypercarb色谱柱（100mm×2.1mm，5μm）（ThermoScientific公司）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；BioGenPRO200型精密匀浆器（PROScientific公司）；EppendorfAG22331Hamburg离心机（GermanyEppendorf公司）。

多巴胺（DA）、肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、5羟色胺（5HT）、5羟吲哚乙酸（5HIAA）、褪黑激素（Melatonin）、γ氨基丁酸（GABA）、酪氨酸（Tyr）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）、牛磺酸（Tau）、丝氨酸（Ser）、色氨酸（Try）、乙酰胆碱（ACh）、组胺（Histamine）对照品均购于Sigma公司；甲醇和甲酸（色谱纯，Fisher公司）；实验用水为MilliQ超纯水。

Wistar大鼠20只（雄性，体重180～200g），适应性喂养1周后，随机分为2组。

2.2实验方法

2.2.1色谱条件流动相A：0.1%甲酸；流动相B：甲醇；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：2μL；梯度洗脱：0～3min，0%B；3～10min，0%～100%B；10～12min，100%～0%B。10～12min流出物切换至废液，不进入质谱检测。

2.2.2质谱条件

电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式，多反应检测（MRM），毛细管电压为3.0kV，离子传输管温度为300℃；雾化器温度为300℃；鞘气流速35arb；辅助气流速5arb。质谱采集参数如表1所示。

2.2.3对照品溶液的配制分别准确称取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh、Histamine对照品各5mg，以0.1%甲酸溶解，分别定容至5mL，配成浓度为1mg/mL溶液。

2.2.4供试样品的处理脑组织样品前处理方法A：取大鼠断头处死，冰台上立即取脑，放于冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸吸干生理盐水，将脑置于冰台上迅速剥离海马体与大脑皮层，称重。冰冷的0.1%甲酸加入到脑组织中，按1KG-3∶KG-510（V/W）匀浆。4℃下，12000r/min离心20min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，待测。

脑组织样品前处理方法B[26＼]：取大鼠断头处死，立即取脑，置于80℃水浴2min后取出，用滤纸吸干水，迅速剥离海马体与大脑皮层，称重。冰冷的0.3%甲酸乙腈加入到脑组织中，按1KG-3∶KG-510（V/W）匀浆。4℃下，12000r/min离心20min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，待测。

3结果与讨论

3.1色谱、质谱条件优化

分别取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh，Histamine对照品的1mg/mL溶液，以0.1%甲酸溶液稀释至5μg/mL。采用直接进样方式，电喷雾离子源（ESI），优化各神经化学物质三重四极杆质谱分析条件，分别尝试正、负离子模式；毛细管电压为2.0～5.0kV；离子传输管温度为200～400℃；雾化器温度为200～400℃；鞘气流速20～50arb；辅助气流速0～10arb。并自动优化各神经化学物质在多反应检测（MRM）时所产生的碎片离子种类和丰度以及所需碰撞能量。

色谱条件优化，考虑到所分析神经化学物质的极性较强、水溶性較好和在色谱柱上的保留问题，尝试了不同类型的色谱柱（C8、C18和Hypercarb），Hypercarb色谱柱以多孔石墨化碳为固定相，对强极性化合物的保留和分离效果更好，且在不同梯度洗脱时，在100%水相条件下，保持稳定的保留和分离；考虑神经化学物质的离子化效率较低的问题，比较了纯水和不同浓度甲酸溶液作为流动相对分离、分析效果的影响，结果表明，0.1%甲酸为流动相时分析效果更佳。最终建立了无需衍生化、对脑组织样品中17种神经化学物质同时定量分析的UPLCMS/MS方法。

3.2方法学考察

3.2.1标准曲线及定量限采用外标法定量，各取适量按照上述方法配制的对照品溶液混合，再根据需要用0.1%甲酸溶液逐级稀释成不同浓度的系列混合对照溶液。以待测物浓度作为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标，得到17种待测神经化学物质的线性回归方程。以信噪比（S/N）>10确定方法的定量限（LOQ）。各神经化学物质的线性范围、相关系数及定量限结果列于表2。

3.2.2精密度配制高、中、低3个浓度水平的混合对照品溶液，平行测定6次，计算各神经化学物质峰面积的RSD，测得日内精密度（Intradayprecision）。连续测定3日，计算各神经化学物质峰面积的RSD，测得日间精密度（Interdayprecision）。测定结果如表2所示。LM

3.2.3加标回收率

取同一脑组织样品匀浆液，分别加入高、中、低3个浓度水平的混合对照品溶液，按照2.2.4节中样品处理方法A操作，平行测定6次，计算各神经化学物质的加标回收率（Recovery），结果如表2所示。

3.2.4重复性取同一脑组织样品匀浆液6份，按照2.2.4小节中样品处理方法A操作，平行测定6次，计算各神经递化学物质峰面积的RSD，测得重复性（Repeatability），结果如表2所示。

3.3脑组织样品前处理方法比较结果

大鼠大脑皮层中17种神经化学物质经UPLCMS/MS分析所得的提取离子流图如图1所示。不同前处理方法下大鼠海马和大脑皮层中17种神经化学物质的含量水平结果如表3所示。所测4组样品均检测到待测的17种神经化学物质，经方法A处理的海马和大脑皮层中5HT、Melatonin、GABA、Gln、Glu、Ser、Gly、Asp、Tyr和Try的测得含量显著高于经方法B处理的海马和大脑皮层中的测得含量；DA、E、NE、5HIAA、ACh、Histamine和Tau的测得含量在经方法A处理的海马和大脑皮层中略高于经方法B处理的海马和大脑皮层。综上所述，脑组织样品前处理方法A优于方法B。

4结论

本实验建立了UPLCMS/MS法对大鼠海马与大脑皮层中生物胺类及氨基酸类17种神经化学物质同时快速检测的方法。利用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用技术的优势，分别优化液相色谱和质谱条件，选择合适的电离模式，对质谱参数进行了优化，对检测的6种生物胺类和11种氨基酸类神经化学物质分别选择一对定性离子对和定量离子对，最终实现对17种神经化学物质的分离、提取及确证，实现了它们的定量分析。此方法可在10min内完成17种神经化学物质同时分析，检测时间短、线性关系较好、方法回收率高、稳定性良好，满足分析要求。本实验对大鼠海马和大脑皮层前处理方式进行探究，对比了两种样品前处理方法，实验结果表明，冷环境处理方式下测得大鼠海马与大脑皮层中神经化学物质含量较高，此方法无需衍生化、操作简单、可直接测定。

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AbstractAnultraperformanceliquidchromatographytandemmass（UPLCMS/MS）spectrometrymethodwasestablishedfordeterminationofthecontentsofbioamineandaminoacidneurochemicalsinhippocampusandcerebralcortexofrat.Hypercarbcolumn（100mm×2.1mm，5μm）wasusedforthesampleseparationwith0.1%formicacidmethanolasthemobilephaseundergradientelution.TheneurochemicalsweredetectedbyMS/MSusingESIionsourceunderpositiveionizationmodewithMRMscan.Bothquantificationandconfirmationionswerechosenforeach6bioamineand11aminoacidneurochemicals.Theinfluenceoftwodifferentprocessingmethodsonthecontentsofneurochemicalsinbraintissueswascompared.Total17neurochemicalsweresimultaneouslydetectedin10min.Thecalibrationcurvewaswithagoodlinearrelationship.Theintradayandinterdayprecision，averagerecoveryandrepeatabilitycouldmeettheanalysisrequirement.ThisUPLCMS/MSmethodshowsexcellentselectivity，accuracy，highsensitivity，specificityandgoodrepeatability，andissuitablefortheseparationandquantizationofbioamineandaminoacidneurochemicalsinbraintissue.

KeywordsUltraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry；Bioamineneurochemicals；Aminoacidsneurochemicals；Braintissue

HQWT6JY（Received27April2016；accepted8June2016）