Ras-MAPK信号通路对蛋鸡卵泡颗粒细胞STMN2蛋白表达的影响

徐剑华，李鹏

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

Ras-MAPK信号通路对蛋鸡卵泡颗粒细胞STMN2蛋白表达的影响

徐剑华，李鹏

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

探讨Ras-MAPK信号通路激活或抑制时对海兰褐壳蛋鸡卵泡颗粒细胞STMN2蛋白表达水平的影响。采用体外培养的颗粒细胞作为实验模型，运用Western blot分析激活剂组、抑制剂组和对照组颗粒细胞中STMN2蛋白表达量。与抑制剂组和对照组相比，激活剂组STMN2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与激活剂和对照组相比，抑制剂组STMN2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。Ras-MAPK通路信号激活，颗粒细胞中STMN2蛋白表达量增加，RasMAPK通路信号抑制，颗粒细胞中STMN2蛋白表达量减少。

STMN2；信号通路；颗粒细胞；激活剂；抑制剂

卵巢作为重要的雌性生物生殖器官，卵泡是构成卵巢的一个基本的结构和功能单位，由一个卵母细胞以及周围的颗粒细胞、卵泡膜细胞组成[1]。已有研究证明：颗粒细胞的发育优于卵母细胞的发育，颗粒细胞合成多种激素和生长因子，并表达多种激素的受体，通过间隙连接调控卵泡的发育[2]，颗粒细胞作为卵母细胞发育的标志，常作为体外培养研究卵泡生理的细胞模型[3]。

MAPK信号通路是迄今为止研究比较透彻的信号转导系统之一，该家族共有四条信号通路，参与介导绝大多数生物细胞的生长、发育、分裂、分化等生理及病理过程[4]。有研究表明，在产蛋期间MAPK信号通路家族成员表达水平显著高于休产期的表达水平。1996年，Belmont等[5]在研究有丝分裂的时候发现Stathmin蛋白，其家族成员包括 STMN1、STMN2（SCG10）、STMN3 SCLIP）、STMN4（RB3）蛋白。Stath－min蛋白参与介导细胞的有丝分裂，与细胞的增殖、分化、再生和运动均有关，具有调节多种信号激酶如MAPK、环磷酸腺苷依赖激酶、蛋白激酶PKC等活性的功能。已有研究表明stathmin与子宫内膜的生理变化有关[6]，STMN2是近些年开始研究的一种微管去稳蛋白，有些机理尚未清楚，但已知其通过磷酸化和去磷酸化调控细胞的有丝分裂。蛋鸡的产蛋率与卵泡发育密不可分，因此，实验将STMN2与Ras-MAPK信号通路联系起来，希望为提高蛋鸡产蛋率提供一种新的思路。

自20世纪80年代，中国从美国海兰公司引进四系配套的海兰褐壳蛋鸡，该蛋鸡以产蛋量高且稳而闻名世界，自引入国内，广受养殖人员的喜爱，养殖场遍布全国。实验为进一步提高产蛋率和延长产蛋周期，以海兰褐壳蛋鸡卵巢颗粒细胞为实验模型，检测Ras-MAPK信号通路与STMN2表达量的关系。为进一步研究如何提高海兰褐壳蛋鸡产蛋率奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）主要仪器设备

TGL16型台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司；Neofuge13型高速普通台式离心机：上海力申科学仪器有限公司；细胞培养箱：GS Laboratory Equipment；BHC-1360ⅡA/B3型生物安全柜：北京东联哈尔仪器制造有限公司；超净工作台：苏州宏瑞净化科技有限公司；SmartSpecTMPlus核酸蛋白测定仪：美国Bio-rad公司。

（2）主要试剂

BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术有限公司；SDS-PAGE凝胶电游试剂盒：索莱宝；

培养液（Hyclone M199）赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；β-肌动蛋白/β-Actin抗体（内参抗体）：北京博奥森生物技术有限公司；Anti-SCG10/ STMN2 Antibody IHC-plus：美国LifeSpan公司U0120：碧云天生物技术有限公司；Curcumin：MCE公司。

（3）实验动物8月龄产蛋期海兰褐壳蛋鸡5只，黑龙江大庆某养鸡场提供。

1.2 方法

1.2.1 海兰褐壳蛋鸡卵巢颗粒细胞原代培养

5只海兰褐壳蛋鸡颈静脉放血致死，选用F1级卵泡，参考Gillbert等[7]提供的方法，剥离卵泡颗粒细胞层。于0.75%的生理盐水中清洗数次，尽量洗去卵黄物质，用眼科剪刀将颗粒细胞膜剪成小于1 mm3大小的小块，12.5 μg·ml-1Ⅰ型胶原酶[8]，37℃消化5 min，吹打数次，颗粒细胞膜混合悬液于200目滤网过滤，收集滤液，1 000 rpm，8 min离心，去掉上清液，生理盐水洗涤，以便清洗残存的卵黄物质和胶原酶，1 000 rpm，8 min离心3次。沉淀的颗粒细胞加入含10.0%胎牛血清的M199培养液制备成颗粒细胞悬液。取10 μL颗粒细胞悬液加入等体积0.1%台盼蓝，用血球计数板计数，细胞存活率在90%以上可用于下一步实验。将细胞悬液接种于6孔细胞培养板，置于37℃，体积分数为5%CO2的细胞培养箱中静置培养。

1.2.2 Ras-MAPK信号通路激活与抑制

将分离的颗粒细胞悬液接种于6孔细胞培养板，置于37℃，体积分数为5%CO2的细胞培养箱中静置培养。48 h后于显微镜下观察颗粒细胞的生长状态及覆盖率，生长状态良好，覆盖率90%以上可用于下一步实验。观察完毕后，细胞更换无血清培养液，置于37℃，体积分数为5%CO2的细胞培养箱中静置培养。实验分为激活剂组、抑制剂组和对照组，每组三个重复。24 h后对应组分别加入激活剂U0126和激活剂Curcumin使培养液的终浓度为50 nmol·L-1。继续培养48 h。然后终止培养。

1.2.3 STMN2蛋白检测

PBS清洗终止培养的细胞，选用碧云天生产的细胞裂解液收集颗粒细胞总蛋白。测定总蛋白浓度，绘制趋势线。激活剂组、抑制剂组和对照组提取的总蛋白经SDS-PAGE电泳（12%的分离胶和5%的浓缩胶），通过半干转膜法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶上转移到0.45 μm的PVDF膜上，转印后的PVDF膜均用5%BSA室温封闭2 h，TBST洗膜5次，每次10 min，洗膜后分别加入相应一抗（STMN2，1∶1 000，β-actin：1∶1 500）。37℃2 h恒温孵育，取出后TBST洗膜5次，每次10 min，放入相应二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜后，采用COR Odyssey双色红外激光成像系统扫描出图像，根据灰度值采用SPSS统计软件进行分析。

1.2.4 统计分析

2 结果

Western blot检测激活剂组、抑制剂组和对照组中的STMN2与β-actin蛋白表达含量。结果见图1。对激活剂组、抑制剂组和对照组间STMN2反应条带进行半定量分析：与抑制剂组和对照组相比，激活剂组STMN2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与激活剂组和对照组相比，抑制剂组STMN2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见表1。

图1 Western blot检测STMN2蛋白表达结果Fig.1 Results of the STMN2 protein expression detected by western blot assay

表1 STMN2分泌量数据分析Table 1 Analysis results of STMN2 production data

3 讨论

禽类的产蛋性能受到品种、饲养环境、疾病等多种多样因素的影响，卵巢中卵泡发育程度与产蛋性能密切相关。卵泡的成熟受到众多的信号通路调节如PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TGFβ信号通路、WNT信号通路、RTK-Ras信号通路、KL/Kit信号通路等信号转导通路的调控[9]。MAPK信号通路介导细胞生长、分化，调控多种细胞的细胞周期。STMN2是一种微管去稳蛋白，通过磷酸化去磷酸化调控细胞有丝分裂，进而调控细胞周期。众所周知，Curcumin是特异性的MEK激动剂，MEK是ERK的上游激酶，在Ser217/221双位点激活MEK后再激活ERK，这与U0126正好相反，U0126高选择性的抑制MEK1和MEK2。实验通过添加激活剂和抑制剂激活和抑制Ras-MAPK信号通路，深入研究激活剂组和抑制剂组中STMN2蛋白表达水平，结果显示与抑制剂组和对照组相比，激活剂组STMN2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与激活剂组和对照组相比，抑制剂组STMN2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。基于实验说明，STMN2蛋白表达受到Ras-MAPK信号通路的影响。

4 结论

近年来，为提高产蛋量和延长产蛋期，实验将与细胞周期有关的信号转导通路和介导细胞有丝分裂的微管去稳蛋白建立联系。希望通过调控细胞周期影响卵泡细胞发育，为提高蛋鸡产蛋性能提供一种新的思路。基于上述实验：得知当Ras-MAPK信号激活时，STMN2蛋白表达量增加；当Ras-MAPK信号受到抑制时，STMN2蛋白表达量降低。

［1］ 沈浣.颗粒细胞与卵母细胞发育［J］.国际生殖健康/计划生育杂志，2012，31（5）：344-347.

［2］ Eppig J.Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals［J］.Reprod，2001，122（6）：829-838.

［3］ 金艳梅.颗粒细胞对卵泡发育的影响［J］.中国畜牧兽医，2010，37（8）：69-72.

［4］ 陈建勇，王聪，王娟，等.MAPK信号通络研究进展［J］.中国医药科学，2011（8）：32-34.

［5］ Danielle N，Casssimeris R L.Gene expression profiles in mouse embryofibroblaets lacking stathmin，a microtubule regulatory protein，revealchanges in the expression of genes contributing to cell motility［J］.BMC Genomics，2009（343）：1-3.

［6］ Nan L，Peng J，Wenjay D，et al.Sival supperesses epithelial-mesenchymal transition and metastasis of tumor cells by inhibiting stathmin and stabilizing microtubules［J］.Proc Natl AcadSci USA，2011，108（31）：12851-12856.

［7］ Gilbert A B，Evans A J，Perry MM，et al.A method for sepa-rating the granulose cells，the basal lamina and the theca ofthe preovulatory ovarian follicle of the domestic fowl（Gallusdomesticus）［J］.Reprod Fertil，1977，50（1）：179-181.

［8］ 王志慧，徐剑华，李鹏.籽鹅FSH真核表达载体的构建及表达［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（4）：39-41.

［9］ 罗峰，谢琪璇，秋山泰身，等.调节卵子发育成熟的信号转导通路［J］.生殖与避孕，2011，31（7）：495-501.

Effect of Ras-MAPK Signaling Pathways on Protein Expression of STMN2 in Granulosa Cells by Hens Ovaries

Xu Jianhua，Li Peng
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To explore the effect of the activation or inhibition of the Ras-MAPK signaling pathway on STMN2 protein expression level in granulosa cells of HY-LINE VARIETY BROWN variety brown，granulose cells were cultured in-vitro as the test model，Western blot was performed to detect the STMN2 protein expression levels in the activator group，inhibitor group and control group. Results showed that as compared to the inhibitor group and control group，there was significant increase in STMN2 protein expression level in the activator group（P＜0.05）；as compared to the activator group and control group，there was significant decrease in STMN2 protein expression level in the inhibitor group（P＜0.05）.Activation of the Ras-MAPK signaling pathway would increase the STMN2 protein expression level in granulose cells，and inhibition of the Ras-MAPK signaling pathway would decrease the STMN2 protein expression level in granulose cells.

STMN2；signal pathway；granulosa cells；activator；inhibitor

Q78

A

1002-2090（2017）02-0035-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.007

2015-12-20

黑龙江省农垦总局课题（HNKXIV-08-10a）。

徐剑华（1989-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2013级硕士研究生。

李鹏，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：86543607@qq.com。