大黄素对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

罗英花，刘畅，孙虎男，臧延青，金成浩

（1.黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院；3.黑龙江八一农垦大学食品学院）

大黄素对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

罗英花1，刘畅2，孙虎男2，臧延青3，金成浩2

（1.黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院；3.黑龙江八一农垦大学食品学院）

研究大黄素对人肺癌A549细胞的药效及其诱导细胞凋亡的分子机制。通过MTT法检测大黄素对A549细胞的杀伤作用；通过Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术检测大黄素对A549细胞的凋亡作用；通过免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白的表达量变化。大黄素对A549细胞具有良好的杀伤作用且呈浓度依赖性；荧光显微镜和流式细胞术检测发现大黄素能够诱导A549细胞的凋亡且呈时间依赖性；Western blot检测显示大黄素处理A549细胞后，p-AKT、Bcl-2的表达量明显减少，Bad和cleaved-caspase-3的表达水平明显增加。大黄素通过调控AKT信号传导途径诱导人肺癌A549细胞的凋亡。

大黄素；人肺癌A549细胞；药效；细胞凋亡；AKT信号通路

肺癌是当前世界各地最常见的肺原发性恶性肿瘤，是发病率和死亡率增长最快，严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一。目前肺癌的治疗手段包括手术切除、化学治疗和放射治疗等。但这些方法只能够延长患者的生存期，不能彻底治疗肺癌[1]。所以寻找能够彻底根治肺癌的药物，提高患者的生存质量迫在眉睫。

大黄素（Emodin，化学名为1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌）是存在于掌叶大黄根茎中的天然蒽醌衍生物，是一种天然的CK2抑制剂[2-3]。相关报道指出，大黄素可以诱导胆管癌QBC-939、口腔鳞癌KBV200等细胞发生凋亡[4-5]，但其对肺癌的药效及药理机制尚不清楚。实验通过细胞生物学和分子生物学方法[6-7]阐明大黄素对人肺癌A549细胞的杀伤作用，诱导细胞凋亡作用以及相关信号转导途径，为大黄素的有效利用以及治疗肺癌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人肺癌A549细胞系购于上海中科院细胞库，由实验室冻存。

1.2 主要试剂仪器

主要试剂：大黄素（＞99.0%）购自美国SIGMA公司，5-氟尿嘧啶（5-FU）购自上海皓元化学科技有限公司，MTT购自美国Amresco公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，抗体p-AKT、AKT、Bcl-2、caspase-3、β-actin、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG购自美国Santa Cruz公司，ECL化学发光试剂购自美国Thermo公司，其余试剂均为国产分析纯。

主要仪器：390302型倒置显微镜，Leica公司；ELX酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；电泳仪、半干转印仪，美国伯乐公司Bio-rad；MicroChemi4.0型化学发光型凝胶成像系统，以色列DNR成像系统有限公司；EVOS FL型全自于动智能成像系统，Life Technology公司；FACSCalibvr型流式细胞仪，美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

人肺癌A549细胞用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素及100 μg·mL-1的链霉素的RPMI1640培养液，在37℃，5%CO2的培养箱中培养。每隔2～3天换培养液，当细胞满度达到70%～80%时进行传代。

1.3.2 MTT法检测细胞存活率

将A549细胞以1×104个/孔的密度接种至96孔板，37℃、5%CO2培养箱里培养24 h。用含有1% FBS的培养液血清饥饿处理2 h，再用不同浓度的大黄素和5-FU（1、3、10、30及100 μmol·L-1）处理24 h（实验中所用到的药物的溶剂均为1%的RPMI1640培养液）。加入15 μL的MTT溶液（5 mg·mL-1），继续培养2～4 h后，用PBS洗涤3次。每孔加入100 μL的DMSO，在摇床上混匀10 min，用酶标仪测量吸光度（A570）值，计算细胞存活率和IC50值。每个实验组设定8个复孔，实验重复3次（空白调零组只加DMSO；对照组每孔加入1 μL DMSO；阳性对照组5-FU每孔加入1 μL 5-FU）。

细胞存活率%=（实验组-空白调零组）/（对照组-空白调零组）

1.3.3 Annexin V-FITC/PI染色观察细胞凋亡

将A549细胞种至6孔板中（2×105个/孔），用30 μmol·L-1的大黄素分别处理细胞不同时间（0、3、6、12、24 h）。参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书，进行染色。通过荧光显微镜观察并分析细胞凋亡情况。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡

将A549细胞种至6孔板中（2×105个/孔），加入30 μmol·L-1的大黄素分别处理细胞不同时间（0、3、6、12、24 h）后，用PBS重悬细胞，离心（7 000 r，5 min），弃上清，加入195 μL的Annexin V-FITC结合液，轻轻混匀，再加入5 μL的Annexin V-FITC，轻轻重悬细胞，加入10 μL的PI，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.5 Western blot检测凋亡相关蛋白表达量变化

收集经过30 μmol·L-1的大黄素分别处理不同时间（0、3、6、12、24 h）后的细胞，提取蛋白，SDSPAGE分离，转膜，5%脱脂乳封闭，一抗（p-AKT、AKT、Bcl-2、caspase-3和β-actin）封闭过夜，二抗（HRP标记山羊抗兔IgG和HRP标记山羊抗鼠IgG）室温孵育2 h，化学发光凝胶成像系统检测。实验重复3次。

1.3.6 统计学处理

实验数据以mean±SD表示，采用SPSS 11.0软件包分析，组间比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 大黄素对A549细胞的杀伤作用

为了检测大黄素对人肺癌A549细胞的杀伤作用，用不同浓度（1、3、10、30、100 μmol·L-1）的大黄素和5-FU（阳性对照组）处理A549细胞24 h后，进行MTT实验。如图1所示，随着大黄素药物浓度的逐渐增加，细胞存活率明显降低并呈浓度依赖性，其存活率分别为81.4±2.3%、75.9±2.1%、56.2±5.7%、41.3± 1.4%及21.7±0.7%。大黄素与阳性对照组5-FU相比对A549细胞的杀伤作用更明显，具有显著性差异（P＜0.05）。经计算，大黄素IC50值为17.52 μmol·L-1。

图1 大黄素对肺癌A549细胞的杀伤作用Fig.1 Cytotoxic effect of emodin on A549 cells

2.2 大黄素对A549细胞形态和荧光染色的影响

为了检测大黄素是否具有诱导A549细胞的凋亡作用，用浓度为30 μmol·L-1的大黄素对A549细胞处理不同时间（0、3、6、12、24 h）后，利用Annexin V-FITC/PI染色，在荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况。如图2A所示，对照组（0 h）细胞生长贴壁较牢固，细胞间紧密相连，细胞边界清晰，细胞膜完整。随着药物处理时间的增加，细胞形态发生明显的变化，细胞体积变小，形态逐渐变圆、不规则，细胞间接触松散，表现出细胞凋亡的典型特征。而且Annexin V-FITC和PI的荧光强度也随着药物处理时间的增加而逐渐增强，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05，图2B）。

2.3 大黄素对A549细胞的凋亡作用

为了进一步验证大黄素对A549细胞的凋亡作用，用浓度为30 μmol·L-1的大黄素对A549细胞处理不同时间（0、3、6、12、24 h）后，利用 Annexin VFITC和PI进行标记，并通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。如图3所示，随着药物处理时间的增加，A549细胞凋亡程度也逐渐增加。尤其是当药物处理时间达到24 h时，细胞凋亡水平最为明显（图3B），提示大黄素能够有效诱导A549细胞的凋亡，并呈时间依赖性。

图2 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况Fig.2 Apoptotic effect of emodin on A549 cells by Annexin V-FITC/PI double staining

图3 流式细胞术检测大黄素对A549细胞的凋亡作用Fig.3 Apoptotic effect of Emodin on A549 cells by flow cytometry

2.4 大黄素对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

为了在分子水平上阐明大黄素诱导细胞凋亡过程中的相关信号途径，用浓度为30 μmol·L-1的大黄素对A549细胞处理不同时间（0、3、6、12、24 h）后，利用Western blot方法检测AKT及其下游蛋白表达量的变化。如图4所示，抗凋亡因子p-AKT，Bcl-2蛋白的表达水平明显下调，而促凋亡因子Bad和cleaved-caspase-3蛋白的表达水平明显上调，说明大黄素通过调控AKT信号通路诱导肺癌A549细胞发生凋亡。

图4 Western blot检测大黄素对细胞凋亡相关蛋白的表达量变化Fig.4 Effect of emodin on expression of apoptotic protein on A549 cells by western blot

3 讨论

近年来，许多国家特别是工业发达国家肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的首位，女性肺癌发病率仅次于乳腺癌，位列第二位，死亡率占第一位。细胞凋亡是一种保守的细胞死亡方式，不仅在正常机体中能够维持细胞数目的平衡，而且与多种疾病的发生密切相关。研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡异常有关，因此寻找一种能够有效诱导细胞凋亡的药物迫在眉睫。

大黄素作为一种新型的ATP竞争性CK2抑制剂可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。大黄素可通过下调JNK及JNK下游分子AP-1的表达从而诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡，也可通过线粒体依赖性途径来抑制细胞增殖并诱导凋亡，其机制为使肿瘤细胞产生活性氧（ROS，reactive oxygen species），随后凋亡调控因子Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，导致线粒体内cytochrome c释放到胞浆进而激活caspase-9和caspase-3的活性[8-9]。

有报道证实，PI3K/Akt信号通路可以阻止肿瘤细胞启动程序性死亡，并促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡，从而促进肿瘤细胞的生存。通路中Akt磷酸化的激活作为Bad强有力的激酶，使Bad的Ser136位点磷酸化，阻断Bad诱导细胞凋亡从而激活下游caspase家族发生级联反应[10]。Caspase-3在细胞凋亡中起到不可替代的作用，可以被多种因素活化，在CTL细胞的杀伤作用中，它既可被Fas/FasL途径活化，也可以通过颗粒酶B途径活化。在凋亡的早期阶段，活化的Caspase-3通过裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[11]。研究结果表明，大黄素对人肺癌A549细胞具有良好的杀伤作用，且随着药物浓度和处理时间的增加，其杀伤作用更加明显；而且Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术结果表明，大黄素可有效诱导肺癌A549细胞凋亡且呈时间依赖性。研究Western blot结果表明，大黄素可下调抑癌蛋白p-AKT，Bcl-2的表达，上调促癌蛋白Bad和cleavedcaspase-3的表达，从而诱导A549细胞的凋亡，证实了大黄素通过AKT介导的线粒体凋亡信号转导途径诱导细胞凋亡。

4 结论

实验通过细胞生物学及分子生物学等方法，阐明大黄素通过调控AKT信号通路诱导A549细胞的凋亡，进而有效抑制A549细胞的增殖。为肺癌以及其他癌症的治疗提供新的理论依据。

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［11］ 毛德文，陈月桥，王丽，等.Caspase-8及Caspase-3与细胞凋亡［J］.辽宁中医药大学学报，2008（10）：148-150.

Effect of Emodin on Proliferation and Apoptosis of Human Lung Cancer A549 Cells and its Mechanism

Luo Yinghua1，Liu Chang2，Sun Hunan2，Zang Yanqing3，Jin Chenghao2
（1.College of Animal Science&veterinary medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Life Science&Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University；3.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

To investigate the pharmacologic effect and apoptotic mechanism of emodin on human lung cancer A549 cells，the viability of A549 cells were measured by MTT assay.The apoptotic effect of emodin on A549 cells was detected by Annexin V-FITC/PI double staining and flow cytometry.The related apoptotic protein expression level was determined by western blotting.Emodin suppressed the proliferation of A549 cells in a dose-dependent manner.The Annexin V-FITC/PI double staining and flow cytometry results showed that emodin could induce A549 cell apoptosis in a time-dependent manner.The western blotting results showed that emodin could significantly down-regulate p-AKT，Bcl-2 protein expression levels while up-regulated the Bad and cleaved-caspase-3 expression levels in A549 cells.Emodin significantly inhibited the proliferation of human lung cancer A549 cells by inducing mitochondrial-related apoptosis via AKT signaling pathway.

Emodin；human lung cancer A549 cell；pharmacologic effects；apoptosis；AKT signaling pathway

Q78

A

1002-2090（2017）02-0064-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.013

2016-05-03

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（201510223003）；黑龙江省自然基金项目（LC2015036）；黑龙江省博士后科研启动项目（LBH-Q13132）；学成、引进人才科研启动计划项目（XYB2013-24）。

罗英花（1976-），女，助理实验师，延边大学毕业，现主要从事抗肿瘤药物药理学方面的研究工作。

金成浩，男，教授，博士研究生导师，E-mail：jinchenghao3727@qq.com。