汽蒸前后六堡茶中优势微生物的分离鉴定

欧惠算，邓旭铭，张灵枝，张均伟，马士成，邱瑞瑾

（1.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；2.梧州中茶茶业有限公司，广西 梧州 543001；3.梧州市农业科学研究所，广西 梧州 543000；4.梧州市六堡茶研究院，广西 梧州 543000）

汽蒸前后六堡茶中优势微生物的分离鉴定

欧惠算1，邓旭铭1，张灵枝1，张均伟2，马士成3，4，邱瑞瑾3，4

（1.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；2.梧州中茶茶业有限公司，广西 梧州 543001；3.梧州市农业科学研究所，广西 梧州 543000；4.梧州市六堡茶研究院，广西 梧州 543000）

选取汽蒸前、后六堡茶茶样，分离纯化得到7株优势菌，采用传统方法观察菌落特征、利用光学显微镜观察菌株的形态，结合分子生物学水平对菌株进行DNA序列分析，通过ITS序列进行同源性搜索比对、对系统发育树分析。结果共鉴定出六堡茶汽蒸前的优势菌为塔宾曲霉、黑曲霉、胶红酵母、LB3青霉、灰黄青霉、鞘氨醇单胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌。而在汽蒸后的六堡茶里没有塔宾曲霉以及黑曲霉，说明其在高温汽蒸时已被杀死，而其余5种微生物因耐高温而保留下，对六堡茶的陈化起到重要作用。

六堡茶；优势微生物；分离；鉴定

六堡茶，因原产于广西省梧州市苍梧县六堡乡而得名，属于黑茶类。我国著名的茶学教授庄晚芳先生根据南北朝时期的《桐君录》考证：六堡茶的历史可以追溯到1 500多年前。《苍梧县志》记载：“茶产多贤乡六堡，味醇隔宿而不变，茶色香味俱佳”［1］。六堡茶与其他黑茶相比，其加工过程中的特殊之处为两次“渥堆”和两次高温汽蒸，其传统加工工艺分为两步：六堡初制加工与六堡茶精制加工，即毛茶和成品茶加工，精制加工流程为：六堡毛茶—加水—翻拌—高温汽蒸—渥堆—高温汽蒸—装篓—陈化—六堡茶［2］。该独特的工艺使得六堡茶具有独特的槟榔香味和“红、浓、陈、醇”的品质特征。在渥堆过程中，有大量微生物生成，温志杰等［3］分析了六堡茶渥堆发酵中微生物的变化，检测到其中存在数量巨大的细菌、酵母、霉菌。廖庆梅［4］发现六堡茶后期陈化的六堡茶有许多金黄色的“金花”，是有益品质的黄霉菌，它能分泌淀粉酶和氧化酶，可催化茶叶中的淀粉转化为单糖。徐书泽［5］通过传统形态学鉴定结合真菌分子鉴定技术从中分离鉴定得到黑曲霉、烟曲霉、桔青霉、西弗射盾子囊霉等5属18种的微生物。汽蒸，是六堡茶加工的关键工艺，汽蒸前后的微生物类群，决定了六堡茶后期陈化的品质，渥堆后的六堡茶，通过高温汽蒸，将不耐高温的微生物杀死，提高茶叶的安全性。本试验以第2次汽蒸前后的六堡茶为样品，分离纯化其中的优势菌，用光学显微镜观察菌落形态，再结合现代分子生物学进行DNA测序，在分子水平上对六堡茶汽蒸前后的优势菌进行鉴定，为提高六堡茶的渥堆技术及安全性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

六堡茶茶样取自广西梧州中茶茶厂，2015 年11月产，蒸前样为刚渥堆好的发酵样；蒸后样为渥堆好汽蒸后的蒸压样，于阴凉避光处保存。

分离培养基：PDA培养基、查氏培养基；纯化鉴定培养基：查氏培养基、20%蔗糖查氏培养基（CZA20S）、改良的20%蔗糖查氏培养基（加2%的六堡毛茶茶汤）。

1.2 试验方法

1.2.1 汽蒸前后六堡茶微生物的分离纯化 分离：分别称量10 g蒸前样、蒸后样六堡茶于250 mL三角瓶中（含玻璃珠），加入90 mL无菌水，于振荡器中振荡15 min，即制成10-1倍菌悬液，在超净工作台上吸取1 mL10-1倍菌悬液加入到装有9 mL无菌水的试管中，得10-2倍稀释菌悬液，以此类推，依次稀释至10-7倍菌悬液。分别取1 mL各稀释浓度的菌悬液置于PDA平板上，用无菌三角玻璃板均匀涂布，每个浓度3次重复，于恒温培养箱内28℃培养7 d。

纯化：选择生长适宜的平板用接种针挑取少许菌丝，用划线分离法在查氏、20%蔗糖查氏、改良蔗糖查氏培养基上进行多次分离培养得到纯种菌株、编号，用试管斜面培养，4℃保存。

1.2.2 菌株的形态学观察 将保存的菌种取出，于28℃活化培养24 h，用三点接种法将菌株接于PDA培养基、20%蔗糖查氏培养基、改良的20%蔗糖查氏培养基上，置于28℃恒温培养箱倒置培养，每天观察菌落的生长情况并做好记录。根据菌株的形态，初步判定菌株的类别，根据类别选择不同的方法进行光学显微镜观察。

（1）真菌用插片法观察：将灭菌的盖玻片呈45～50°插入查氏和20%蔗糖察氏培养基，待菌丝扩展至盖玻片，取出将其放在载玻片上（粘有菌丝的一面朝上），在光学显微镜下观察并拍照。（2）细菌用油镜观察法：革兰氏染色后，用油镜进行显微观察，拍照记录。（3）酵母菌用直接观察法：酵母为单个细胞，吕氏美蓝染液染色后，用光学显微镜观察。

1.2.3 菌株的DNA序列分析 用划线法培养菌株5 d后，按照生工真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒的说明书进行菌株DNA的提取，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提的DNA基因组，对成像单一且较亮的基因组进行PCR扩增。

（1）真菌PCR扩增。引物：ITS1F（5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）；ITS4（5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）。

反应体系（25 μL）：DNA模板1.5 μL；ExTaq酶（TaKaRa）12.5 μL；IFS1F引物（10 μmol/L）各0.5 μL；ddH2O补足至25 μL。反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72℃延伸10 min。

（2）细菌PCR扩增。引物：27F（5′-AG AGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′）；1492R （5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′）。

反应体系（50 μL）：2×Premix Taq （TaKaRa） 25 μL，引物（10 μmol/L） 各2 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O补足至50 μL。反应条件为：94℃预变性5 min; 94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸3 min，进行30个循环，72℃后延伸10 min，

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，成像系统拍照。将PCR纯化产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序。将得到的序列在NCBI数据库中使用Blastn 软件进行同源序列比对，通过MEGA6 软件构建系统发育树。选用邻位相连法（Neighbor-joining）构建进化树，用自展检验（Bootstrap ）做验证的进化树分析，随机搜索设置为1 000。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

通过对汽蒸前后两个六堡茶茶样微生物的分离培养（图1，封三），得到的菌株根据其形态特征初步归类划分，依次编号为LB1～LB7，六堡茶汽蒸前的优势菌为7株，汽蒸后的样品中没有检测到LB5菌株和LB7菌株，说明高温汽蒸使这两株菌致死，而剩余的5株菌，由于耐高温而存活下来。将LB1、LB2、LB5、LB6、LB7分别接种于PDA与查氏培养基上，LB3接种于查氏与改良的20%蔗糖查氏培养基上，LB4接种于查氏与20%的蔗糖查氏培养基上，进行菌落形态，以及光学显微镜观察，结合真菌鉴定手册对其进行初步鉴定。

2.1.1 LB1菌株形态 菌落在PDA上易生长，菌落小，直径约1.2 cm，圆形或者椭圆形，表面湿润光滑，呈黄色，中凸，粘稠，不透明，后期湿润菌落易散开。根据上述对该菌菌落及显微镜观察结果，初步鉴定该菌株为细菌（图2，封三）。

2.1.2 LB2菌株形态 菌落呈圆球，中央隆起，边缘整齐，湿润不透明，胶状，表面具有光泽，直径约1.2 cm。正面呈深红色，背面呈粉红色。光学显微镜下，用吕氏美蓝染液染色观察，细胞呈球形或卵圆形，直径约4 μm，单个、成对或成链。根据上述对该菌菌落及显微镜观察结果，结合《中国真菌志》及《真菌鉴定手册》该菌株初步鉴定为酵母属（图3，封三）。

2.1.3 LB3菌株形态 LB3菌株在PDA上长得很慢，在20%蔗糖查氏上长得较快，在加了2%六堡毛茶茶汤的20%蔗糖查氏培养基上长得最快，最茂盛，菌落呈蘑菇状，菌丝为白色，绒丝状，菌落底部有较硬的褐色梗，菌落背面有裂纹，成熟后为深褐色，菌丝分布较杂乱，菌丝交叉处有红褐色近球形或椭圆形子囊，无孢子。根据上述对该菌菌落及显微镜观察结果，结合《中国真菌志》及《真菌鉴定手册》该菌株初步鉴定为：青霉属（图4，封三）。

2.1.4 LB4菌株形态 菌落在察氏琼脂培养基上生长缓慢，在20%蔗糖察氏培养基生长较快，其生长速度为75 mm/14d，菌落为绒状，中间微隆起，整体呈金黄色，有同心环纹路，中间部位较边沿更黄，黄色闭囊壳丰富，成熟后为黄褐色，菌落中心部位有长放射性脊，菌丝有隔，呈不对称分枝，培养5 d左右其上分布暗灰绿色的分生孢子头，分生孢子梗茎较长，分生孢子串生，为球形或者近球形，尺寸为4.5～4.9 μm，表面粗糙，培养7 d，有大量成熟的分生孢子脱落在菌丝周围。菌落背面呈棕褐色，衰老后颜色变深，无脊光滑。结合《中国真菌志》及《真菌鉴定手册》该菌株初步鉴定为散囊菌属（图5，封三）。

2.1.5 LB5菌株形态 LB5菌落在查氏琼脂培养基上，于28℃条件下培养7 d，直径达4.8 cm，菌丝体白色，质地丝绒状，菌落灰褐色；有同心圆，无渗出液；菌落反面为淡灰黄色。分生孢子近球形，结构较密，易产分生孢子，分生孢子近球形，直径3 μm，壁近光滑。菌落在PDA培养基上生长迅速，菌丝茂盛，灰黑色，菌落有同心圆，背面为灰色，培养5天即可产生大量孢子，孢子成近球形。根据上述对该菌菌落及显微镜观察结果，结合《中国真菌志》及《真菌鉴定手册》该菌株初步鉴定为曲霉属，塔宾曲霉（图6，封三）。

2.1.6 LB6菌株形态 LB6菌落在查氏培养基上于28℃条件下培养7 d直径1.2 cm，生长快，菌落近圆形，正面为深绿色，边缘白色，质地平坦，背面呈黄绿色，每枝的末端细胞分裂成串的分生孢子，形成扫帚状，分生孢子梗壁近光滑。分生孢子一般呈蓝绿色，孢子较多，易脱落，成熟后随风飞散，遇适宜环境，萌发成菌丝。根据上述对该菌菌落及显微镜观察结果，结合《中国真菌志》及《真菌鉴定手册》该菌株初步鉴定为：青霉属，灰黄青霉（图7，封三）。

2.1.7 LB7菌株形态 LB7菌落在查氏琼脂培养基上，生长迅速，于28℃条件下培养7 d，直径达4.8 cm，菌丝质地丝绒状，长满黑色分生孢子，表面呈暗褐色或炭黑色，正面有同心圆，菌落反面呈灰褐色。分生孢

了头为球形，直径约50 μm，分生孢子梗壁光滑，分生孢子近球形，直径约3 μm。分生孢子成熟后易脱落。根据上述对该菌菌落及显微镜观察结果，结合《中国真菌志》及《真菌鉴定手册》该菌株初步鉴定为：曲霉属，黑曲霉（图8，封三）。

2.2 分子鉴定结果

将以ITS1F与ITS4为引物扩增得到的序列片段在NCBI数据库的BLAST工具中进行比对，应用MEGA6软件构建发育树，确定菌株的归属，结果见图9。

图9 六堡茶分离菌株的基因组DNA纯度检测以及ITS-PCR产物电泳图

基于序列相似性达到97%以上的基因克隆子才能定义为同一种物质，而分离出的LB3菌株的相似性只有88%，所以只能确定该菌株为青霉属。经过大量的文献查阅以及反复验证得出：该菌株可能是茶叶中特有的菌种，目前尚未有相关的分子鉴定报道，在NCBI数据库中没有相应的序列记录，所以比对的相似性比较小。由于LB1分子序列在Blast上的比对结果中，前十几种都为鞘氨醇单孢菌，且相似性均在99%以上，所以没有进行发育树的构建，确定LB1为鞘氨醇单孢菌（Sphingomonas sp.，表1）。

根据以上分子序列比对结果以及所构建的系统发育树系统（图10、图11），鉴定得出5个属7种微生物，包括细菌1种：鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）；酵母属1种：胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）；散囊菌属1种：阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）；青霉属2种：灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）、Capsulatum 青霉；曲霉属2种：黑曲霉（Aspergillus niger）、塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）。

2.3 菌株最终鉴定结果分析

菌株的ITS分子鉴定结果结合菌株的形态学鉴定结果，最终得到5个属7个种微生物，其中形态学无法鉴定的LB1、LB2、LB4菌株通过分子学方法分别鉴定为鞘氨醇单胞菌、胶红酵母、阿姆斯特丹散囊菌。而LB3在NCBI数据库中的比对结果相似性小于97%，只能确定其为青霉属。本试验用传统的形态学观察法结合现代分子生物学技术来鉴定菌株，使结果更加科学严谨。试验得出：六堡茶汽蒸前的优势菌为塔宾曲霉、黑曲霉、胶红酵母、LB3青霉、灰黄青霉、鞘氨醇单胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌；而在汽蒸后没有塔宾曲霉以及黑曲霉，说明其在高温汽蒸时已被杀死，而其余的5种微生物因为

耐高温而保留下来。所以汽蒸后的优势菌为胶红酵母、LB3青霉、灰黄青霉、鞘氨醇单胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌。

表1 六堡茶分离菌株的Blastnd的比对结果

图10 菌株LB2、LB3、LB4、LB5、LB6系统发育树

图11 菌株LB7系统发育树

3 结论与讨论

LB3菌株虽然还不能确定到种，但本试验可以肯定其属于六堡茶中的真菌，因为在分离汽蒸前后的六堡茶优势菌时都得到该菌，且在分离过程中，用玻璃棒涂布平板时，该菌在PDA中易生长，菌落较茂密，而纯化时在PDA中却很难生长，原因是在涂布时培养皿上有1 mL茶汤为其提供必需营养，鉴于这一现象，本试验改良了20%的蔗糖查氏培养基，加入2%六堡毛茶茶汤，对LB3菌株进行培养，发现其在有茶汤的培养基上生长迅速，白色绒状菌丝茂盛，可以确定该菌株为六堡茶中的真菌。至于其序列在数据库中的比对值较低，原因可能是目前还没有该菌的相关报道，在数据库中没有相应的序列记录，所以目前只能确定LB3菌株为青霉属。

散囊菌属真菌是存在于黑茶中的优势菌种，不同品种茯砖茶有冠突散囊菌、谢瓦散囊菌、肋状散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌等优势菌［6］；六堡茶的优势菌种也包括散囊菌属。陈庆金等［7］研究发现，在六堡茶陈化初期不同阶段真菌群落曲霉属和散囊菌属为主。本试验从六堡茶中分离纯化得到的金花菌株，具有耐高温性，经过传统形态学分析结合ITS 序列同源性搜索比对确定为阿姆斯特丹散囊菌，这与毛彦等［8］的试验结果不同，其鉴定六堡茶的金花菌为雪黄散囊菌，与陈然等［9］试验结果也不同，其选取多家梧州六堡茶龙头企业生产的六堡茶产品进行真菌分析，结果得出不同厂家六堡茶产品的优势菌种包括冠突散囊菌、谢瓦氏散囊菌等散囊菌属真菌。以上差异可能是由于实验茶样来自不同的茶厂，堆的时间和温度不同，导致成品茶中的“金花”菌种不同。由此可见，六堡茶中的“金花”菌也具有多样性。

存在于黑茶中的优势菌黑曲霉能产生酸性蛋白酶、糖苷酶、葡萄糖淀粉酶和乳酸酶等多种酶。可以将毛茶中的多糖、脂肪、蛋白质、纤维素等大分子化合物分解为单糖、可溶性碳水化合物、多肽及各种氨基酸等小分子物质，可以增强茶汤的滋味及甘滑、醇厚的品质特点［5］。酵母菌含有极丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、脂肪、粗纤维素、碳水化合物、矿物质及微量元素等，有利于普洱茶形成甜醇、爽滑的品质风格［10］。散囊菌属真菌可以产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等多种酶系，能将茶叶中的大分子物质分解，使茶叶风味提高［10］，其还具有降脂、减肥、促进消化、改善人体肠道的功效，其发酵产物胞外多糖还具有抑制肿瘤的功效［11］，彭晓赟等［12］研究发现，从冠突散囊菌中提取的化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和普通变形杆菌具有显著的抑制作用。 Yoshiaki等［13-14］研究发现，从蜡叶散囊菌NE-1和NE-4两个菌株发酵液中，鉴定出具有较高的抗氧化能力，对清除DPPH自由基和过氧化物具有显著效果的5种化合物。本试验将用单株菌种发酵六堡毛茶，进一步探索这7种优势菌对六堡茶品质以及功能的影响，以期为六堡茶的加工、利用和发展奠定一定的理论基础。

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（责任编辑 白雪娜）

Isolation and identification of dominant microorganisms of Liupao tea before and after steaming

OU Hui-suan1，DENG Xu-ming1，ZHANG Ling-zhi1，ZHANG Jun-wei2，MA Shi-cheng3，4，QIU Rui-jin3，4
（1.College of Horticuture，South China Agricultutal University，Guangzhou 510642，China；2.China Tea （Wuzhou） Co.，Ltd，Wuzhou 543001，China；3.Agricultural Science Research Institute of Wuzhou，Wuzhou 543000，China；4.Wuzhou Liupao Tea Research Institute，Wuzhou 543000，China）

Steaming is the key technology in the process of Liupao tea. seven dominant microorganism strains were separated from Liupao tea samples before and after steaming technology .With the traditional methods to observe the colony strain morphological characteristics，and the optical microscope observation，combined with the molecular biology level of strain for DNA sequence analysis，and through ITS sequence homology search comparisons and analysis of phylogenetic tree，the seven dominant strains from Liupao tea before steaming were identified as Aspergillus tubingensis，A. niger，Rhodotorula mucilaginosa，Penicillium sp，P. griseofulvum，Sphingomonas sp，Eurotium amstelodami. And from the Liupao tea after steaming，A. tubingensis，A. niger，were not detected，they were killed during high temperature steaming，while the rest five microorganisms had high temperature resistance，were important in the aging of Liupao tea.

Liupao tea；dominant microorganisms；isolation；identification

S571.1

A

1004-874X（2017）02-0129-07

2016-11-30

广东省自然科学基金（5300-E12237）；梧州市科学研究与技术开发计划项目（201501024）

欧惠算（1991-），女，硕士，E-mail：781088344@qq.com

张灵枝（1972-），女，博士，副教授，E-mail：lingzhi@scau.edu.cn

欧惠算，邓旭铭，张灵枝，等.汽蒸前后六堡茶中优势微生物的分离鉴定［J］.广东农业科学，2017，44（2）：129-135.