不同品种蝴蝶兰2种病毒的ELISA检测及其症状表现

谢林娜++苏梦芸++朱明明++贡宏涛++朱丽梅++徐敏++张波

摘要：采用酶联免疫法对来源于国内不同蝴蝶兰种植场9个蝴蝶兰品种的45个样本携带建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的情况进行检测调查。结果表明：（1）9个蝴蝶兰品种的45株苗中共有9株感染建兰花叶病毒，感染率为20%，强阳性概率为2.2%；9个品种中均有样本检测出齿兰环斑病毒，45株苗中有32株感染齿兰病毒病，感染率为711%，强阳性率为37.8%；另有8株苗发生复合感染，感染率为17.8%，蝴蝶兰中齿兰环斑病毒的发生情况要明显重于建兰花叶病毒。不同品种蝴蝶兰植株感染病毒后，在叶片上的病毒病症状初期主要表现为叶片上有明显的褪绿、黄化现象，但有的病株不仅表现出黄化、褪绿，还形成了明显的黄色斑点、斑纹以及疱状结构，尤其是感染齿兰环斑病毒和复合感染2种病毒的病株均发现发病的叶片后期会出现黑色向内凹陷的坏死斑，部分品种的花也出现了异常症状，如红色花瓣黄化和花瓣出现坏死斑。

关键词：蝴蝶兰；建兰花叶病毒；齿兰环斑病毒；ELISA检测

中图分类号：S436.8+1文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）03-0080-03

收稿日期：2015-12-28

基金项目：江苏省大学生创业创新计划（编号：201513573029Y）；江苏省南京市江宁区科技发展计划（编号：2015Ed01）。

作者简介：谢林娜（1993—），女，江苏徐州人，主要从事蝴蝶兰病毒检测研究。E-mail：492205674@qq.con。

通信作者：朱丽梅，博士，教授，主要从事园艺植物病虫害及防治的教学与科研工作。E-mail：910703164@qq.com。

蝴蝶兰是兰科蝴蝶兰属（Phalaenopsis）中重要的观赏植物，兰花病毒病一直是嚴重危害蝴蝶兰品质的一类重要病害，目前世界上已报道的兰花病毒有25种，寄主范围广泛、易传染、防治困难。其中发生最广、危害最严重的是建兰花叶病毒（Cymbidium mosaie potexvirus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot to-bamovirus，ORSV），且经常发生复合感染的情况。这2种病毒能使兰花叶片形成褪色斑、坏死斑、花叶斑等症状，致使蝴蝶兰植株生长不良、叶片无光泽、花朵质量下降，甚至植株死亡，降低了蝴蝶兰的观赏价值和经济价值，给蝴蝶兰的生产企业带来严重的经济损失[1-3]。目前国际上对蝴蝶兰病毒病还未有防治的有效药剂，因此对病毒病的早期发现，早期隔离处理病株非常有必要，但蝴蝶兰病株早期通常只有轻微的症状表现，或根本不表现病症，通过单纯的症状观察已经无法确认，必须利用病毒检测技术鉴定后才能确定是否染病并筛选无毒苗供进一步无性繁殖试管苗，所以病毒检测技术也是进行植物脱除病毒工作的前提必备条件，通过病毒检测技术鉴定出哪些植株携带有规定病毒，才能确定脱毒试验的研究对象[4-5]。

酶联免疫吸附法（ELISA）是目前国内外检测兰花病毒应用范围最广的检测技术，与传统方法相比具有检测灵敏度强、特异性高以及检测速度快的优点，其中双抗体夹心ELISA和三抗体夹心ELISA应用最为广泛。有研究表明，该方法对兰科不同属类的2种主要病毒CymMV和ORSV的检测具有较高的精确度和稳定性，目前是兰花病毒检测的常规手段[6-9]。基于上述缘由，本研究采用双抗体夹心ELISA和三抗体夹心ELISA对国产蝴蝶兰种苗主要来源地（广东省、江苏省等基地）生产的9个蝴蝶兰品种试管苗携带2种主要病毒的情况进行检测调查，以期了解国内蝴蝶兰生产用苗携带病毒的真实状况，同时本研究还对不同花系感染2种病毒后的症状进行了比较和分析，以期为蝴蝶兰的种植及兰花病毒病害防治提供参考和依据。

1材料与方法

1.1试验材料

蝴蝶兰检测样本为从广东省、江苏省等蝴蝶兰种植基地购买的试管苗，一共3个色系9个品种，其中红色花系包括巨宝、汕农凤凰、超群九号、香妃4个品种，样品编号分别为247、359、257、363；粉色花系包括芝娃娃、五彩珍珠，样品编号分别为207、732；黄色花系包括万花筒、黄金男孩、幻想曲，样品编号分别为369、890、743。

样品提取缓冲液、包被缓冲液、PBST缓冲液、ECI缓冲液、PNP缓冲液、包被用的抗体（CymMV和ORSV）、碱性磷酸酶标记物（CymMV和ORSV），还有96孔微孔板，阳性对照品等购自上海必优生生物公司，其余药品均为分析纯，购自生工生物工程（上海）技术服务有限公司。

1.2试验方法

本试验对温室中不同品种的蝴蝶兰植株进行标记，每个品种5株成熟植株作为检测样本，采取样本叶片作为检测材料，运用ELISA血清法进行病毒检测，统计阳性率。

[JP+1]本试验采用ELISA血清学检测方法，分别对样品建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）2种兰花病毒进行独立互不干扰的病毒检测工作，[JP+1]由于2种病毒的检测操作方法基本相同，所以以下试验步骤均适用于2种病毒的检测。[JP]

1.2.1DAS-ELISA方法检测ORSV的步骤

1.2.1.1包被酶标板和孵育

每孔加抗体溶液100 μL，将酶标板置于4 ℃条件下过夜（但不要长于24 h）。孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，再加入250 μL PBST缓冲液，之后快速倒出，2次以上。洗好后将微孔板倒扣在吸水纸上以弄干孔中残留液体。

1.2.1.2样品的提取及点样孵育

[JP2]本试验以蝴蝶兰植株的叶片作ELISA试验的检测样品，将叶片剪碎后，再用研钵将其研磨至绿色汁液全部浸出，在每份样品提取后彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染。样品研磨后，按1 ∶[KG-*3]10[样品质量（g） ∶[KG-*3]提取缓冲液体积（mL）]的比例在提取缓冲液中研磨样品。[JP]

根据试验设计图表，取100 μL样品提取稀释液于各样品孔中，取100 μL样品提取缓冲液于阴性对照孔中，取 100 μL 阳性质控物溶液于阳性对照孔中。之后将微孔板放在恒湿箱中，置于冰箱4 ℃条件下过夜。

1.2.1.3酶标记物的制备

点样孵育时间结束后即进行洗板，将反应孔中的试剂倒出，再加入250 μL PBST缓冲液，之后快速倒出，重复7次。之后在各反应孔中加入100 μL酶标记物稀释液，在恒湿箱中室温（25 ℃）下孵育2 h。

1.2.1.4显色与读数

酶标记物孵育结束后进行洗板，步骤同“1.2.1.3”节，重复8次。之后在各反应孔中加入100 μL PNP底物溶液，在恒湿箱中避光孵育60 min。出现颜色反应后，以2 mol/L NaOH溶液终止反应，在酶标仪上以波长 405 nm 读数。

1.2.2TAS-ELISA方法检测CyMV的步骤

除加入的包被抗体和酶标抗体不一样，操作步骤与“1.2.1”节所述相同。“1.2.1”节中的包被抗体是兔抗ORSV，酶标抗体是碱性磷酸酶标记兔抗ORSV，本法中的包被抗体是鼠抗CymMV和酶标抗体是碱性磷酸酶标记兔抗-鼠抗CymMV。

1.2.3数据分析

根据P/N值对所测样品的带毒情况进行评估，其中P/N<2视为阴性，P/N≥2视为阳性（染病），P/N>5视为强阳性。利用SPSS软件对脱毒试验中的数据进行显著差异性分析，P/N=样品孔D405 nm/阴性孔D405 nm。

2结果与分析

2.1不同品种蝴蝶兰2种病毒的ELISA检测结果

由表1可知，9个蝴蝶兰品种的45株苗中共有9株感染建兰花叶病毒病，感染率为20%，强阳性概率为2.2%，其中247、369、890号这3个品种的样本中均没检测出建兰花叶病毒，743号品种样本的感染率最高，为60%，其次为363号品种，感染率为40%。所检测的9个品种均有样本检测出齿兰环斑病毒，被检测的45个样本中，32株感染齿兰病毒病，总计感染率为71.1%，强阳性率为37.8%。另有8株苗发生复合感染，感染率为17.8%，其中743、359、207号的感染率最高，达到100%，3个品种的强阳性率也分别达到40%、80%、20%，其次为890，5个样本中有4个阳性，369品种病毒的感染率最低，为20.0%，这45个样本2种病毒检测结果说明蝴蝶兰齿兰环斑病毒的感染情况要明显重于建兰花叶病毒。

2.2不同品种蝴蝶兰病毒病的症状观察

所检测的9个蝴蝶兰品种，无论是感染建兰花叶病毒还是感染齿兰环斑病毒或者复合感染，病株营养生长初期在叶片上表现出明显的褪绿、黄化（图1-2、图2-1、图2-2、图3-2、图4-1、图5-1、图6-1、图7-1），有的病株在初期不仅表现出黄化，还形成了明显的黄色斑点、斑纹等花叶症状（图1-1、图3-1、图6-2、图6-3、图7-1、图7-2、图8-1、图8-2、图9-1、图9-2、图9-3），感染齿兰环斑病毒和复合感染的病株发病叶片上出现明显的坏死斑，也有的病株样本叶片出现大量、小的坏死凹陷斑，如890号复合感染的病叶（图6-3），207号单独感染齿兰环斑病毒的病叶（图3-3、图3-5），其余病株样本则出现较大的、黑色凹陷病斑（图3-6、图4-3、图5-2、图7-2、图9-4），部分品种的花也出现了症状，如开红花的247、257号花瓣明显黄化（图1-3、图7-3），207、743号花瓣出现坏死斑（图3-4、图3-5、图9-5）。

3结论与讨论

本试验利用ELISA法对国内一些较大型蝴蝶兰生产基地常规品种的试管苗进行2种主要兰花病毒的检测和调查。数据显示，9个蝴蝶兰品种的45株苗中共有9株感染建兰花叶病毒病，感染率为20.0%，强阳性概率为2.2%，32株感染齿兰病毒病，感染率为71.1%，另有8株苗发生复合感染，感染率为17.8%。其中743、359、207号的感染率最高，达到100.0%，3个品种的强阳性率也分别达到40.0%、800%、20.0%，说明我国生产蝴蝶兰种苗品质不容乐观，各兰花基地种苗生产所面临的品种由于严重带毒而导致品质退化。

据报道，兰花病毒病的症状极其复杂，不同病毒病在不同时期侵染相同品种的兰花，其症状各异；同种病毒侵染相同品种的兰花，其症状也不尽相同。在栽培过程中，品种、栽培环境、季节、本身营养条件等都会影响症状的表现。本研究发现，无论是红花品种还是黄花品种，不同品种蝴蝶兰植株感染病毒后，在叶片上都会形成明显的病毒病症状，所检测的9个品种无论是感染建兰花叶病毒还是齿兰环斑病毒或者复合感染，在营养生长初期病株的叶片上表现出明显的褪绿、黄化症状， 感染齿兰环斑病毒和复合感染的病株发病时叶片上出现[FL）]

[FK（W9][TPXLN9.tif；S+5mm][FK）][LM]

[KH*4D]

明显的坏死斑。因此，兰花植株是否有病毒病，是感染了建兰花叶病毒还是齿兰环斑病毒，或是其他病害，仅仅从症状上判断是很不准确的，仍然须要通过ELISA等方法测定才能确诊，因此蝴蝶兰的早期检测以及脱毒研究引入生产环节势在必行。

参考文献：

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