罗非鱼细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌拮抗菌株的筛选和鉴定

李梦茜 +张振旺

摘要：嗜水气单胞菌是动物和人类的致病菌，会引起水产动物败血症和人类腹泻病等，对我国已造成了巨大的经济损失。采用细菌的分离、纯化和筛选等步骤，获得对嗜水气单胞菌引起罗非鱼败血症有抑制作用的菌株LFJK-11，并对其形态特征和生理生化特性进行分析。结果显示，该菌株属于链霉菌属。通过对其16S DNA比对及其系统进化树构建，该菌株与链霉菌属相似性达到100%，该结果与其形态特征和生理生化鉴定结果一致。

关键词：罗非鱼；嗜水气单胞菌；败血症；链霉菌；筛选；鉴定；形态特征；生理生化特征

中图分类号： S943.125.42+9文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0129-02

收稿日期：2016-01-28

基金项目：生物化工广西重点学科（河池学院）建设基金（201308）；广西高校中青年教师基础能力提升项目（编号：KY2016LX286）；河池学院校级重点科研课题（编号：XJ2016ZD001）；广西壮族自治区级大学生创新创业训练主项项目（编号：201610605079）。

作者简介：李梦茜（1986—），女，河南周口人，硕士，讲师，从事微生物药物学。E-mail：limengxi66@126.com。

通信作者：张振旺，博士研究生，从事生物技术研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）广泛存在于含水量丰富的土壤、淡水、污水、沼泽和粪便中，一部分是动物和人类的致病菌，会引起水产动物败血症和人类腹泻病等[1-2]。嗜水气单胞菌一直严重危害着水产动物养殖业和人类健康，已造成了巨大的经济损失[3]。据不完全统计，我国每年水产动物养殖业因疾病造成的经济损失超过100亿元[4]，可见水产养殖病害防治的任务十分艰巨。运用生物防治的手段筛选和应用嗜水气单胞菌拮抗菌，应用于水产养殖，减少化学试剂的使用，以减少水产养殖业的经济损失。

1材料與方法

1.1材料

指示菌为嗜水气单胞菌HCLF-2，由笔者所在实验室从患败血症的罗非鱼中分离得到；以嗜水气单胞菌HCLF-2为指示菌，从土壤分离筛选获得拮抗菌株 LFJK-11。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株的筛选

采用平板稀释培养法[5]培养菌株，根据微生物菌落特征（大小、形状、边缘形状、表面结构、光泽、透明度和颜色）将单菌落挑出并编号。将所获得的土壤单菌落用PDA 培养基在28 ℃条件下培养4 d，采用抑菌圈法，以嗜水气单胞菌HCLF-2为指示菌，筛选对嗜水气单胞菌HCLF-2抑菌作用的菌株并保存。

1.2.2拮抗菌株的培养特征

选择拮抗性能最佳的菌株，并将其接种于蔗糖察氏、燕麦、无机淀粉、马铃薯、葡萄糖酵母膏培养基中，在28 ℃下培养3～7d，观察并记录待测菌在不同培养基上的生长形态、基内菌丝、气生菌丝及色素。

1.2.3生理生化特征的鉴定

测定纤维素水解、明胶液化、碳源利用、淀粉水解和H2S 产生等试验[6]。

1.2.4菌株16S rDNA序列的测定及其系统发育树的构建

将菌株LFJK-11接种在LB 培养基上振荡培养12～18 h，参照文献[7]的方法提取基因组DNA。以DNA 组为模板，以16S rDNA基因扩增通用引物进行PCR扩增，扩增出16S rDNA，[JP3]其中引物序列为：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-[JP]3′；1492R。5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。用1% 琼脂糖凝胶进行电泳分离，用DNA 胶回收试剂盒纯化，然后直接寄至上海生工测序部进行测序。将测序结果在NCBI 上进行比对分析，筛选出9株菌株16S rDNA的全序列，使用ClustalW软件构建系统进化树。

2结果与分析

2.1拮抗菌株筛选结果

经拮抗检测筛选到1 株对嗜水气单胞菌HCLF-2有较强拮抗作用的菌株，编号为LFJK-11，抑菌圈直径平均为156 mm（图1）。如表1 所示，LFJK-11菌株对苏云金杆菌、金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌也有一定的拮抗作用，且该菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌效果最强，对黑霉菌抑菌效果最弱；发酵液稀释30～60 倍后对这几种病原菌仍有拮抗作用，可见该菌株发酵性能良好。

2.2拮抗菌株培养特征观察

用划线法将菌株分别接种在蔗糖察氏、燕麦、无机淀粉、马铃薯、葡萄糖酵母膏培养基上，于28 ℃下培养7 d，结果如表2所示，葡萄糖酵母膏培养基上的菌株生长最好，生长速度较快，菌落较大，边缘呈放线状向外扩散，表面干燥有突起，孢子呈圆形，具有土腥味。马铃薯培养基菌株生长优良，向外扩散能力较强，且在培养3 d时菌落中出现金黄色疣，孢子呈链状且菌落紧实不易挑取，培养7 d时颜色逐渐变深表面出现粉状。

2.3菌丝特征

2.3.1MS培养基

应用插片法观察菌丝特征，即分别在培养7、25 d后从MS培养基上取出插片，放在载玻片上滴加清水，放入40倍光镜下观察，结果如图2所示，LFJK-11菌株菌丝较细，无隔膜，呈垂直直线状，分枝较多，如树枝般相互紧密交叉。待气生菌丝成熟后，逐渐分化成圆形孢子。菌丝颜色由浅色至深黑色。

2.3.2种子培养基

洗下MS培养基上的LFJK-11菌株菌落[CM（25]，转接到种子培养基中，于30[KG*3]℃、150[KG*3]r/min下培养3、7、[CM）]

[FK（W9][TPLMQ2.tif][FK）]

9 d，[JP2]再分别用结晶紫染色后在40倍光镜下观察，结果如表3所示，菌株菌丝细长，生长旺盛，呈放射状向外生长并逐渐缩短增粗，致密交联在一起，最终菌丝团松散、断裂并向四周扩散。

2.4LFJK-11菌株生理生化特性

多种生理生化试验结果如表4所示，LFJK-11菌株产淀粉水解酶、H2S，可以液化明胶，但不产纤维素酶，葡萄糖是比较理想的可利用的碳源。

2.5LFJK-11菌株16S rDNA序列测定及其系统发育树的构建

LFJK-11菌株基因组测序所得16S rDNA 碱基序列，于 NCBI数据库BLAST上进行比对，选取12株同源性高的菌株，构建系统进化树，结果如图3 所示，LFJK-11菌株以100% 的同源性屬于链霉菌属。

3结论与讨论

菌株的拮抗菌，经鉴定为链霉菌。通过抑菌试验发现，LFJK-11菌株发酵液抑菌效果强，可以运用其发酵液来防治水产病原物。本试验对LFJK-11菌株的生长特征、生理生化特征及其菌丝和基质特征进行研究，并对其进行16S rDNA测序比对并构建生物树，最终确定该菌株为链霉菌属菌株，所得结果与常规生理生化鉴定结果一致。

本试验属首次对LFJK-11菌株生长特征进行研究，且其发酵产物对于嗜水气单胞菌HCLF-2菌株拮抗作用显著，是一种较好的拮抗菌，对水产动物病原菌有较强的抑制活性，起抗病能力。此研究对于探寻水产动物及人类肠道病原物的生物防治以及水产业的发展有着十分重要的作用。

[HS2]参考文献：

[1]陆承平. 致病性嗜水气单胞菌综述[J]. 水产学报，1992，16（3）：282-286.[HJ1.95mm]

[2]陈怀青. 气单胞菌研究进展[J]. 鱼类病害研究，1997，19（3）：18-33.

[3]Hanninen M L.Phenotypic characteristics of the three hybridization groups of Aeromonas hydrophila complex isolated from different sources[J]. Journal of Applied Bacteriology，1994，76：455-462

[4]陈爱平. 2005年中国水产养殖病害监测报告（一）[J]. 科学养鱼，2006（8）：48-49.

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赵万乐，李艳玲，朱松波，等. 稀释液中添加L-半胱氨酸对鸡精液室温保存的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（3）：131-133.