北疆早熟棉区棉花黄萎病病菌的生物学特性

惠慧 张学坤+赵建军+艾尼江

摘要：为明确新疆北疆早熟棉区黄萎病病菌的菌落类型及培养特性，于棉花黄萎病发病高峰期采集北疆早熟棉区典型发病地的病株进行分离和鉴定，并测定其生物学特性。结果表明：所有供试菌株均为菌核型；25、20 ℃分别为菌丝生长、产孢的最适温度，33 ℃时绝大部分菌株仍能缓慢生长，并产生少量孢子；pH值在4～9范围内菌株均可生长，pH值在5～7范围内菌株生长较快；6.25%的菌株致死温度、时间为65 ℃、10 min，37.50%的菌株致死温度、时間为60 ℃、10 min，56.25%的菌株致死温度、时间为55 ℃、10 min。

关键词：北疆；早熟棉区；棉花；黄萎病；生物学特性

中图分类号： S435.621.2+4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0066-04

新疆是我国最大的优质商品棉生产基地，2012年该地区种植棉花面积为165万hm2，棉花产量为308万t，占全国总产量的比例首次超过50%，已连续20年实现棉花面积、单产、总产和调出量全国第一[1]。近年来，棉花黄萎病在新疆主要植棉区大范围发生，发病程度中度及中度以上的病田占48.1%，重病田占 24.1%，严重威胁新疆棉花的可持续发展[2]。北疆棉区的黄萎病发生程度较南疆重[3]，由于北疆棉区杂交棉品种较少，自2013年开始从黄河流域棉区大量引入杂交棉种子，而黄河流域棉区落叶型黄萎病已普遍发生，导致新疆棉花落叶型黄萎病种群明显增加[4]。目前，北疆棉区黄萎病发生面积不断扩增、急性枯死型症状明显增加，生长中后期有些棉田甚至绝产，这主要与黄萎病扩展迅速且黄萎病病菌易受环境影响产生新的致病类型、土壤中病原菌的逐年累积、强致病力类型菌株增多等有关[5]。

针对北疆早熟棉区黄萎病发病日趋严重的情况，本研究有针对性地采集了典型发病地的病株进行分离和鉴定，并测定其生物学性状，了解北疆早熟棉区黄萎病病菌的菌落类型及培养特性，为北疆棉花抗病育种、品种合理布局及病害防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1菌株的分离纯化

[JP2]2013—2014年于棉花黄萎病发病高峰期，在北疆第五师、第七师和第八师各选取5个典型重病地采集病株，[JP3]进行病原菌分离、纯化与保存；对照菌株V991由南京农业大学提供。

1.2不同温度对菌株生长和产孢的影响

将直径为5 mm的菌块接种于PDA平板上，分别置于15、20、25、30、33 ℃恒温培养箱中培养，重复3次。用十字划线法测量恒温培养第5、第10天的菌落直径；观察记载 25 ℃ 条件下培养第15天的菌落形态，然后在每皿中加入 10 mL 无菌水，洗下的孢子液用血球计数板测定其浓度。

1.3不同pH值对菌株生长的影响

将直径为5 mm的菌块分别接种于pH值为4、5、6、7、8、9的PDA平板上，置于25 ℃恒温培养箱中恒温培养，10 d后测量其菌落直径，重复3次。

1.4菌丝致死温度的测定

将直径为5 mm的菌块置于加有1 mL无菌水的已灭菌1.5 mL EP管中，分别在温度为45、50、55、60、65、70 ℃的水浴锅中处理10 min，然后将菌块取出置于PDA平板上，10 d后观察其生长情况，重复3次。

1.5数据处理与分析

原始数据用Excel进行处理后，采用SPSS 17.0进行方差分析，通过Duncans法进行多重比较。

2结果与分析

2.1棉花黄萎病病菌的培养性状观察

在北疆早熟棉区（第五师、第七师、第八师）采集的病株上共分离到65个菌株，经镜检鉴定为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.），然后进行形态学鉴定，在每个师各筛选5个菌株作为供试菌株。

供试菌株在PDA平板上生长的菌落大多为圆形或椭圆形，少数为不规则形状。15个供试菌株及对照菌株V991均属于菌核型，可产生大量微菌核，其中9个菌株（包括V991）的微菌核呈从内向外放射状，占所有菌株的 56.25%；其余7个菌株的微菌核呈同心轮纹状，占43.75%；菌丝致密的菌株（包括V991）有13个，占所有菌株的81.25%；菌丝稀疏的有3个，占18.75%（表1）。

2.2不同温度条件对菌株生长速度和产孢量的影响

供试菌株在不同温度条件下，其生长速度存在差异性。

由表2可见，供试菌株在15～30 ℃条件下均可生长，但在 33 ℃ 条件下，V1、V2、V5、V15等4个菌株完全停止生长，其余菌株生长极缓慢。在不同温度条件下供试菌株的产孢量之间差异明显。由表3可见，15～30 ℃条件下各菌株均可产孢，但在33 ℃条件下菌株V2不产孢，其余菌株均可产孢，但产孢量极少，平均值为0.5×107个/mL。25 ℃条件下，第五师、第七师和第八师菌株的平均生长速度最快（图1），但在20 ℃条件下平均产孢量最多（图2）。33 ℃条件下菌株生长速度最慢，产孢量也最少。

2.3不同pH值条件下菌丝的生长情况

不同pH值条件下菌落生长情况差异明显。表4表明：供试菌株在pH值为4～9范围内均可生长，pH值在5～7范围内生长速度较快，pH值为4时生长速度最慢。

第五师、第七师和第八师的菌株在pH值为6时生长速度最快，pH值为4时生长速度最慢。

2.4菌丝致死温度的测定

由表5可知，供试菌株中只有V3的致死温度为65 ℃，时间为10 min，仅占6.25%；其中有5个菌株及对照V991菌丝的致死温度、时间为60 ℃、10 min，占37.50%；其余9个菌丝的致死温度、时间为 55 ℃、10 min，占56.25%。第五师5个菌株中除V3外，V1、V2菌株的菌丝致死温度、时间均为 60 ℃、10 min，其余2个菌株的菌丝致死温度、时间均为 55 ℃、10 min；第七师5个菌株中V7的菌丝致死温度、时间为60 ℃、10 min，其余4个菌株的菌丝致死温度、时间均为 55 ℃、10 min；第八师5个菌株中V11、V13的菌丝致死温度、时间为60 ℃、10 min，其余3个菌株的菌丝致死温度、时间均为55 ℃、3讨论

北疆早熟棉区黄萎病病菌的菌落以菌核型为主，这与以前同类研究结果[6]基本一致。Pullman等研究表明，30～33 ℃ 会抑制黄萎病病菌的生长和孢子的萌发[7]，本研究结果与之相似。本研究中33 ℃时有75%的菌株仍能缓慢生长，并产生少量孢子，這与张莉等的研究结果[8]不一致，表明北疆早熟棉区黄萎病病菌的耐高温能力可能有所增强，这也可能是造成当前新疆棉花黄萎病在高温期仍然发病较重的原因之一。30 ℃ 条件下发现有个别菌株由菌核型转为菌丝型，这与朱荷琴等研究的高温胁迫下温度对病原菌的培养特性有影响[9]一致。pH值在4～9范围内菌株均可生长，pH值在5～7范围内菌株生长速度较快，表明pH值是影响棉花黄萎病病菌生长的因素之一。6.25%菌株致死温度、时间为 65 ℃、10 min，3750%菌株致死温度、时间为60 ℃、10 min，56.25%的菌株致死温度、时间为 55 ℃、10 min， 表明北疆早熟棉区黄萎病病菌对高温具有一定的耐受性，籍秀琴等认为高温可明显控制黄萎病的发生[10]，棉田遭遇连续高温容易产生隐症，但是一旦环境条件适宜即可暴发成灾。

本研究仅从北疆早熟棉区中的第五师、第七师和第八师采集了15个重病田的病株，只能代表北疆早熟棉区局部黄萎病病菌的类型。下一阶段的任务是广泛采集病样，进行PCR分子鉴定及致病力分化研究，以便为新疆棉花黄萎病的防控提供理论依据。

参考文献：

[1]新华网. 新疆棉花产量首次超过全国一半[EB/OL]. （2012-12-28）[HJ1.9mm][2015-09-10]http：//news.Xinhuanet.corn/fortune/2012-12/28/e-114194610.htm.

[2]刘海洋，王伟，张仁福，等. 新疆棉花黄萎病发生调查及病原菌系统进化分析[J]. 新疆农业科学，2015，52（1）：65-71.

[3]缪卫国，田逢秀. 新疆棉花枯、黄萎病发生趋势及研究现状[J]. 新疆农业科学，2000（增刊1）：107-109.

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[5]李国英，张新全，宋玉萍，等. 北疆棉区棉花黄萎病发生趋势、抗性研究[J]. 新疆农业科学，2015，52（1）：185-190.

[6]李国英，霍向东，田新莉，等. 新疆棉花黄萎病菌的培养特性及致病性分化的研究[J]. 石河子大学学报（自然科学版），2000，4（1）：9-15.

[7]Pullman G S，Devay J E.Epidemiology of Veticillium wilt of cotton： effects of disease development on plant phenology and line yield[J].Phytopathology，1982，72（5）：554-559.

[8]张莉，马慧宁，陈文霞，等. 石河子地区棉花黄萎病菌致病型监测研究[J]. 安徽农业科学，2007，35（16）：4879-4880，4882.

[9]朱荷琴，宋晓轩，简桂良. 温度胁迫对棉花黄萎病菌致病力的影响[J]. 棉花学报，2003，15（1）：33-36.

[10]籍秀琴，马存. 棉花黄萎病消长与温度关系的分析[J]. 农业科技通讯，1980（8）：30-31.