CK5/6、EGFR、p53与Ki67在乳腺癌组织中的表达及其意义

杨宇峰，李镔薇，林思园，张利华，杨梅

（东莞市第三人民医院病理科1、乳腺科2，广东东莞523326）

CK5/6、EGFR、p53与Ki67在乳腺癌组织中的表达及其意义

杨宇峰1，李镔薇1，林思园2，张利华2，杨梅2

（东莞市第三人民医院病理科1、乳腺科2，广东东莞523326）

目的检测表皮生长因子受体(EGFR)、细胞角蛋白5/6(CK5/6)、p53蛋白(p53)和细胞增殖核抗原Ki67(Ki67)在乳腺癌中的表达及其表达的相关性，并探讨其与乳腺癌患者的临床和病理特征的关系。方法回顾性分析东莞市第三人民医院2010年1月至2011年12月间108例经病理确诊的乳腺癌患者的临床及病理资料。免疫组化检测EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌组织中的表达，Spearman相关分析蛋白表达的相关性，χ2检验或Fisher精确检验分析蛋白表达与患者临床及病理指标之间的关系。结果EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌组织中阳性表达率分别为17.6%(19/108)、25.9%(28/108)、42.6%(46/108)和51.9%(56/108)；EGFR与CK5/6和p53呈正相关(r=0.282，r=0.241)，CK5/6与p53和Ki67呈正相关(r=0.217，r=0.190)，p53和Ki67呈正相关(r=0.193)，相关性均有统计学意义(P＜0.05)；EGFR、CK5/6、p53和Ki67在三阴乳腺癌组织中的表达比非三阴乳腺癌组织中的表达更高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CK5/6或EGFR阴性的乳腺癌患者比较，CK5/6或EGFR阳性的乳腺癌患者的中位复发时间相对较短，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论EGFR和CK5/6在乳腺癌组织中的高表达提示CK5/6和EGFR可以作为乳腺癌预后不良因素。

表皮生长因子受体；细胞角蛋白5/6；p53蛋白；细胞增殖核抗原Ki67；乳腺癌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。近年来，分子标记物在乳腺癌的诊疗及预后判断中起着越来越重要的作用。EGFR属于1型生长因子受体家族成员，乳腺癌患者EGFR的过表达预示其预后差。CK5/6属于细胞角蛋白家族成员，是免疫组化诊断基底细胞样型乳腺癌的一个重要标记物。p53是具有肿瘤抑制和转录活性的抑癌基因，其突变与乳腺癌的发生有一定的相关性。Ki67是一种与细胞增殖特异相关的核蛋白，可用来评价乳腺癌细胞增殖活性,且对判断乳腺癌患者预后有重要意义。尽管已有不少研究评价这些标记物在乳腺癌中的表达，但是较少联合检测这些标记物在乳腺癌中的表达及其意义。本文主要通过免疫组化检测EGFR、CK5/6、P53和Ki67在乳腺癌中的表达，分析它们表达的相关性，并探讨其与乳腺癌患者的临床和病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集东莞市第三人民医院2010年1月至2011年12月间经病理确诊的乳腺癌标本108例，所有组织样本均行免疫组化检测。乳腺癌的诊断、分级及分期标准参照2012版乳腺肿瘤WHO分类。108例患者中女性107例，男性1例；年龄32～75岁，平均54岁；肿瘤大小≤2 cm者54例，＞2 cm者54例；有淋巴结转移者35例，无转移者73例；组织学分级Ⅰ级7例，Ⅱ级48例，Ⅲ级53例；临床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期55例，Ⅲ期21例，Ⅳ期1例。三阴性癌(即ER-、PR-及HER2-)22例，非三阴性癌86例，其中管腔A型(Luminal A型，即ER+和/或PR+、HER2-)62例、管腔B型(Luminal B型，即ER+和/或PR+、HER2+)11例、HER2阳性型(即ER-、PR-、HER2+)13例。

1.2 免疫组化检测乳腺癌组织的石蜡标本连续切片，经脱蜡、微波修复抗原，孵育单克隆一抗及二抗，DAB显色，苏木素对比染色，观察阳性染色的部位及强度。每批染色均设置阳性、阴性对照，已知阳性的乳腺癌组织切片为阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。所有抗体包括：ER、PR、HER2、EGFR、CK5/6、p53及Ki67，均购于北京中杉公司。ER/PR阳性定义为在肿瘤细胞核中出现阳性着色且着色细胞≥1%，而ER/PR阴性为在肿瘤细胞核不着色或着色细胞＜1%[1]。HER2的免疫组化染色评价采用0～+++评分系统[2]。染色强度0和+为阴性，染色强度+++为阳性，而染色强度++的病例需进一步行FISH检测确定有无HER2基因扩增。EGFR和CK5/6阳性为任何数量浸润性癌细胞胞浆和或胞膜着色[3]。p53和Ki67阳性为肿瘤细胞核着色≥10%[4]。

1.3 HER2的FISH检测HER2免疫组化染色强度++的病例进一步行FISH检测确定有无HER2基因扩增。FISH检测遵循试剂盒说明书的建议，试剂盒购于安必平公司。HER2基因扩增定义为HER2/CEP17比率超过2.0。总之，HER2阳性为免疫组化染色强度+++和或FISH检测HER2基因扩增，而HER2阴性为免疫组化染色强度0/+和/或FISH检测HER2基因无扩增。

1.4 统计学方法应用SPSS16.0统计软件分析数据。蛋白表达与临床病理资料之间的关系采用χ2检验或Fisher精确检验。蛋白间的关联性分析采用Spearman相关分析。Kaplan-Meier法计算生存曲线并比较生存曲线间的差异。Cox比例风险回归模型分析影响乳腺癌预后的独立风险因素。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌组织中的表达免疫组化结果显示EGFR表达定位于胞膜，CK5/6表达定位于胞浆，p53和Ki67表达定位于胞核(图1)。EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌组织中的表达阳性率分别为17.6%(19/108)、25.9%(28/108)、42.6%(46/108)和51.9%(56/108)。

图1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌组织中的表达

2.2 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌组织中表达的相关性Spearman相关分析结果显示：EGFR与CK5/6、p53呈正相关(r=0.282，r=0.241)，CK5/6与p53和Ki67呈正相关(r=0.217，r=0.190)；p53和Ki67呈正相关(r=0.193)，相关性均有统计学意义(P＜0.05)。其余蛋白间不存在表达相关性。

2.3 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系在108例乳腺癌中，EGFR、CK5/6和p53在三阴乳腺癌组织中的表达比非三阴乳腺癌组织中的表达更高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但是它们的表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、病理分级、组织学类型等临床及病理指标之间均无统计学意义(P＞0.05)；Ki67在三阴性乳腺癌和组织学分级高组的表达率高于非三阴性乳腺癌和组织学分级低组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而其表达与其他临床病理指标之间无明显相关性，差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.4 EGFR、CK5/6、p53和Ki67表达与乳腺癌复发的关系EGFR阳性的乳腺癌患者和阴性患者中位复发时间分别为38个月(18～77个月)及43个月(22～79个月)，EGFR阳性的乳腺癌患者比EGFR阴性的乳腺癌患者有相对较短的中位复发时间，差异具有统计学意义(P=0.002)。CK5/6阳性的乳腺癌患者和阴性患者中位复发时间分别为41个月(22～77个月)及46个月(18～79个月)与CK5/6阴性的乳腺癌患者比较，CK5/6阳性的乳腺癌患者的中位复发时间相对较短，差异具有统计学意义(P=0.017)(图2)。p53和Ki67差异性表达与肿瘤中位复发时间无统计学相关性(P= 0755，P=0.069)。Cox多因素回归分析显示EGFR、CK5/6、p53和Ki67差异性表达不是影响乳腺癌复发的独立因素。

表1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67的表达与乳腺癌临床病理参数的关系(例)

图2 K-M法计算EGFR和CK5/6表达与乳腺癌复发之间的关系

3 讨论

乳腺癌是一种异质性肿瘤，根据基因表达类型可将乳腺癌分为5个主要亚型：腺腔A型、腺腔B型、HER2过表达型、基底细胞样型和正常乳腺样型[5-6]。

各分子亚型的临床特征、治疗敏感性及预后均存在很大差异。由于乳腺癌基因分型对送检标本要求高，需要新鲜组织，检测价格昂贵，且实际操作困难，因此临床上仅通过免疫组化半定量测定ER、PR和HER2等分子标记物的表达来判断乳腺癌的类型，与准确的分子亚型略有不同。

目前临床上常将乳腺癌分为三阴性癌和非三阴性癌，而三阴性癌具有侵袭性强、局部复发率高和远处转移早、预后差的特点。目前在临床上对该类患者尚无特异性的靶向治疗方法，内分泌治疗及化疗效果也不明显。三阴性乳腺癌中85%与基底细胞样型在免疫表型特征上相关[4]，此外还包含了部分正常乳腺样型。Nielsen等[7]认为ER、PR及HER2均阴性，且CK5/6和(或)EGFR阳性者被称为基底细胞样乳腺癌。依据上述定义，我们研究队列中基底细胞样乳腺癌占比为15.7%(17/108)，接近Nielsen等[7]报道的结果。

细胞角蛋白CK5/6是乳腺基底细胞产生并表达的产物，属于CK家族成员之一。本研究显示在三阴性乳腺癌中CK5/6阳性表达率为59.1%(13/22)，而非三阴性癌中其阳性表达率为17.4%(15/86)，CK5/6在三阴性及非三阴性癌中表达差异有统计学意义(P＜0.05)，提示三阴性乳腺癌是一类具有特殊起源的乳腺癌，有可能起源于乳腺组织的基底层中。

EGFR属于I型生长因子受体家族成员。EGFR过度表达可促使乳腺肿瘤细胞增殖、血管生成，进而促进细胞转移、抑制细胞凋亡[8]。本研究显示在三阴性乳腺癌中EGFR阳性表达率为45.5%(10/22)，而非三阴性癌中其阳性表达率为10.5%(9/86)，EGFR在三阴性及非三阴性癌中表达差异有统计学意义(P＜0.05)，提示EGFR过表达在三阴性乳腺癌的发生发展中可能起重要作用。

Cheang等[3]回顾性分析了3 744例浸润性乳腺癌，发现以三阴性乳腺癌标准定义的基底细胞样型乳腺癌占所有乳腺癌的17%，而以ER、PR、HER2阴性再加上CK5/6和EGFR五项指标来定义的基底细胞型乳腺癌仅占9%，并且发现五项指标定义的基底细胞样型乳腺癌的预后比三阴性乳腺癌差，此结果提示CK5/6和EGFR阳性乳腺癌患者预后不良。我们的研究发现CK5/6或EGFR阳性的乳腺癌患者中位复发时间相对较短，支持CK5/6和EGFR阳性预示乳腺癌患者预后不良。此外，CK5/6与EGRF之间存在共表达性，提示两者在乳腺癌的不良预后中可能发挥协同作用。

p53是常见的抑癌基因，野生型具有抑癌功能，而突变型与人类肿瘤的发生密切相关。本组研究显示p53在乳腺癌中阳性表达率为42.6%，与Cianga等[9]报道的p53阳性率结果相近。笔者发现p53在三阴性乳腺癌中表达阳性率(72.7%)明显高于在非三阴性乳腺癌的阳性率(34.9%)。但并未发现p53的差异性表达与年龄、组织学类型、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、临床分期等重要临床病理参数相关，可能与本研究样本数量较少有关，在以后的研究工作中将增加样本数量继续探讨。

Ki67是一种与细胞增殖特异性相关的核抗原，主要用于判断细胞增殖活性，通常在乳腺癌的预后及治疗方面起指导作用[10]。本研究显示Ki67在三阴性乳腺癌中阳性率(72.7%)明显高于在非三阴性乳腺癌中阳性率(46.5%)，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明Ki67的高表达预示乳腺癌患者不良预后。

总之，除了检测ER、PR和HER2的表达状态外，通过免疫组化联合检测CK5/6、EGFR、p53和Ki67等分子标记物有助于综合评价乳腺癌生物学行为及预后判定，为临床选择治疗方案及个体化治疗提供依据。

[1]Hammond MEH,Hayes DF,Dowsett M,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer(unabridged version)[J].Arch Pathol Lab Med,2006,131(1):907-922.

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[4]张朝林,李宏,李金平.p53、Ki67、EGFR、Nm23在乳腺癌组织中的表达及临床意义[J].海南医学,2014,25(1):15-17.

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Expression of CK5/6,EGFR,p53 and Ki67 in breast cancer and their significance.

YANG Yu-feng1,LI Bin-wei1, LIN Si-yuan2,ZHANG Li-hua2,YANG Mei2.Department of Pathology1,Department of Breast Surgery2,Dongguan Third People's Hospital,Dongguan 523326,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of cktokeratin5/6(CK5/6),epidermal expression of growth factor receptor(EGFR),p53 and nuclcar-associated antigen Ki67(Ki67)in breast cancer,and investigate the association of their expression with clinical and pathological features in breast cancer.MethodsWe performed a retrospective analysis of 108 breast cancer patients from Dongguan Third People's Hospital between January 2010 and December 2011.Expression of EGFR,CK5/6,p53 and ki67 were detected in breast cancer tissues by immunohistochemical methods,and their expression correlation was analyzed by Spearman analysis.Chi-square or Fisher's exact test was used to investigate their relationships with clinical and pathological indexes.ResultsOut of the 108 cases,the positive rates for EGFR, CK5/6,p53 and Ki67 were 17.6%(19/108),25.9%(28/108),42.6%(46/108)and 51.9%(56/108),respectively.Correlation analysis indicated positive correlation between EGFR and CK5/6,p53(r=0.282,r=0.241),positive correlation of CK5/6 with p53 and Ki67(r=0.217,r=0.190),and positive correlation between p53 and Ki67(r=0.193)(P＜0.05 for all). Expression of EGFR,CK5/6,p53和Ki67 were found significantly up-regulated in triple negative breast cancer compared to non-triple negative breast cancer(P＜0.05 for all).Median time to relapse was shorter for the patients with CK5/ 6 or EGFR-positive tumors compared to the ones with CK5/6 or EGFR-negative cases(P＜0.05).ConclusionThe up-regulated expression of EGFR and CK5/6 in breast cancer may be correlated with a worse prognosis.

Growth factor receptor(EGFR);Cktokeratin5/6(CK5/6);p53;Ki67;Breast cancer

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.009

R737.9

A

1003—6350（2017）08—1233—04

2016-10-27)

广东省东莞市科技计划医疗卫生类科研一般项目（编号：20131051010064）

杨宇峰。E-mail：y313yang260@163.com