淡紫拟青霉固体发酵条件初步研究*

赵俊杰 王继雯 ** 巩 涛 刘 莉 岳丹丹 李冠杰 杨文玲 甄 静 杜志敏 陈国参 刘杏忠

（1河南省微生物工程重点实验室 河南郑州 450008 2河南省科学院生物研究所有限责任公司 河南郑州 450008 3中国科学院微生物研究所国家真菌学重点实验室 北京 100101）

植物线虫病是严重影响作物生长的主要病害之一，每年植物寄生线虫给全球农业造成的损失高达千亿美元［1－2］。中国也是受植物线虫病严重影响的国家之一，每年仅因线虫侵染导致小麦发病的土地面积就达 6.7 万 hm2以上［3－4］。 而防治植物寄生线虫通常以化学杀虫剂为主，但化学杀虫剂的生产和使用给环境和土壤带来严重污染,同时造成药物残留，危害人类健康［5］。而生物防治剂具有安全环保的优点，成为防治线虫研究的热点。淡紫拟青霉是一种广泛分布于土壤和植物根系的习居菌，能寄生于根结线虫、孢囊线虫等植物线虫上，在侵染线虫过程中可通过菌丝机械压力和分泌的胞外酶联合作用，使线虫卵和虫体破裂而死，是一种具有防治植物线虫作用的生防菌株［6－7］。淡紫拟青霉属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科拟青霉属，具有末端膨大的分生孢子梗，分生孢子为椭圆形或纺锤形，无色至黄色，宽2～4 μm，呈平滑链状［8］。 目前淡紫拟青霉的生产以液体发酵为主，但液体发酵存在一些不足，例如生产成本高、孢子含量不高、能耗较高、制剂保存时间短等［9］。与液体发酵相比，固体发酵具有原料价格低廉、设备简单、产物加工方便等优点，采用固体发酵法生产淡紫拟青霉，可降低生产成本，环保节能，无需处理大量的废水和废弃物，是一种比较理想的生产方式［10］。本研究对淡紫拟青霉固体发酵条件进行初步研究,为其工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1）菌种：淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus），由本实验室分离保存。

2）试剂：硝酸钾、蔗糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、氯化锰等试剂，均为国产分析纯。

3）仪器：HYG－A全温摇瓶柜，太仓市实验设备厂；DRP－9052型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；Nikon 50i显微镜，日本尼康公司。

4）培养基：种子培养基：蔗糖 30 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH自然。基本发酵培养基：麸皮10 g加水10 mL组成。

1.2 方法

1.2.1 种子液的制备 无菌条件下，从长满淡紫拟青霉孢子的PDA平板上接菌块于种子培养基中，取100 mL种子培养基装入250 mL锥形瓶中，在温度为30℃，转速为180 r/min的摇床上培养72 h。

1.2.2 分生孢子数的测定 准确秤取淡紫拟青霉发酵好的基质1.0 g，加入10 mL无菌水，用研钵充分粉碎，收集孢子悬液，在显微镜下采用血球计数板测定分生孢子数。

1.2.3 发酵培养基初筛 分别选用麸皮和玉米粉1∶1、麸皮和米糠 1∶1、麸皮和豆饼粉 1∶1、玉米粉和米糠 1∶1、玉米粉和豆饼粉 1∶1、米糠和豆饼粉 1∶1 代替基础发酵培养基中的麸皮。将上述培养基10 g装入250 mL锥形瓶中，加入水10 mL，拌匀于121℃灭菌30 min，冷却后按占干料重5%比例接入孢子种子液，在30℃下培养10 d后测定孢子数。

1.2.4 培养基组成单因素实验

1）麸皮与玉米的比例对产孢的影响。将麸皮与玉米分别按 0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和 6∶1的比例混合均匀，在250 mL锥形瓶中装入10 g混合料和10 mL水，拌匀后于121℃灭菌30 min，冷却后按5%比例接入孢子种子液，在30℃下培养10 d后测定孢子数。

2）料水比对产孢的影响。将麸皮与玉米按4∶1的比例混合均匀，在250 mL锥形瓶中装入10 g混合料，改变料水比分别为 1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2 拌匀后于 121℃灭菌 30 min， 冷却后按5%比例接入孢子种子液，在30℃下培养10 d后测定孢子数。

3）不同无机盐对产孢的影响。将麸皮与玉米按4∶1的比例混合均匀，在250 mL锥形瓶中装入10 g混合料，按料水比 1∶0.6比例加入水，按占干料重0.5%分别加入氯化锌、氯化镁、氯化钙、氯化钾、氯化锰和硫酸亚铁，拌匀后于121℃灭菌30 min，冷却后按5%比例接入孢子种子液，在30℃下培养10 d后测定孢子数。

4）氯化锰含量对产孢的影响。将麸皮与玉米按4:1的比例混合均匀，在250 mL锥形瓶中装入10 g混合料，按料水比1∶0.6比例加入水，按占干料重 0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和 1%的添加量加入氯化锰，拌匀后于121℃灭菌30 min，冷却后按5%比例接入孢子种子液，在30℃下培养10 d后测定孢子数。

5）培养基初始pH值。将配好的发酵培养基分别用1 mol/L的HCl和NaOH调pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0，经 121℃灭菌 30 min，冷却后按5%比例接入孢子种子液，在30℃下培养10 d后测定孢子数。

1.2.5 培养基组成正交实验 根据单因素实验结果，以产孢子数为考察指标，设计4因素3水平的正交实验，麸皮与玉米粉比例因素水平为3∶1、4∶1 和 5∶1；料水比因素水平为 1∶0.5、1∶0.6 和 1∶0.7；氯化锰含量因素水平为0.4%、0.5%和0.6%；初始pH值因素水平为6.0、7.0和8.0。

1.2.6 培养条件单因素实验

1）接种量。将麸皮与玉米按4∶1的比例混合均匀，在250 mL锥形瓶中装入10 g混合料，按料液比1∶0.6比例加入水，按占干料重0.6%加入氯化锰，调节pH为 7.0，拌匀于 121℃灭菌 30 min，冷却后分别按2%、4%、6%、8%和10%接种量接入孢子种子液，于30℃下培养10 d后测定孢子数。

2）培养温度。将麸皮与玉米按4∶1的比例混合均匀，在250 mL锥形瓶中装入10 g混合料，按料液比1∶0.6比例加入水，按占干料重0.6%加入氯化锰，调节pH为7.0，拌匀于121℃灭菌30 min，冷却后按6%比例接入孢子种子液，分别在温度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃培养 10 d后测定孢子数量。

3）培养时间。将麸皮与玉米按4∶1的比例混合均匀，在250 mL锥形瓶中装入10 g混合料，按料液比1∶0.6比例加入水，按占干料重0.6%加入氯化锰，调节pH为7.0，拌匀于121℃灭菌30 min，冷却后按6%比例接入孢子种子液，在温度25℃下分别培养 5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d 后测定孢子数量。

1.2.7 培养条件正交实验 根据单因素实验结果，以产孢子数为考察指标，设计3因素3水平的正交实验，接种量因素水平为5%、6%和7%；培养温度因素水平为20℃、25℃和30℃；培养时间因素水平为7 d、8 d和9 d。

2 结果

2.1 发酵培养基初筛 培养基初筛结果如图1所示，培养基的组成为麸皮和玉米粉1∶1时，分生孢子数最高，为6.7×109CFU/g。其次是玉米粉和米糠 1∶1，分生孢子数为 5.6×109CFU/g，而培养基组成只为麸皮时，分生孢子数为4.0×109CFU/g。因此，适合淡紫拟青霉固体发酵培养基的基质组成为麸皮和玉米粉。

图1 发酵培养基初筛结果

2.2 培养基组成单因素实验 如表1所示，在培养中添加适量的玉米粉对淡紫拟青霉产孢具有促进作用，麸皮与玉米粉组成比例为4∶1时，分生孢子数最高，为8.5×109CFU/g。料水比对固体发酵影响较大，料水比过低或过高都不利于淡紫拟青霉的产孢，料水比为1∶0.6时，分生孢子数最高，为9.3×109CFU/g。添加不同的无机盐对淡紫拟青霉产孢的影响不同，氯化锰能促进淡紫拟青霉的产孢，而氯化锌、氯化镁、氯化钙、氯化钾及硫酸亚铁均对淡紫拟青霉产孢有抑制作用。氯化锰的含量为0.6%时，分生孢子数最高，为10.7×109CFU/g,。中性环境有利于淡紫拟青霉生长产孢，偏酸或偏碱环境都不利于其生长，培养基初始pH值为7时，分生孢子数最高。

表1 培养基组成单因素实验结果

2.3 培养基组成正交实验 培养基组成正交实验结果如表2所示。

表2 培养基正交实验结果

由表2可知，培养基的最佳组合为A2B2C3D1，即麸皮和玉米粉 4∶1、料水比 1∶0.6、氯化锰含量 0.6%、初始 pH 6.0，分生孢子数最高，为 12.9×109C－FU/g。由极差值R分析可知，影响分生孢子数的因素顺序为A＞D＞C＞B，即麸皮和玉米粉比例＞初始pH值＞氯化锰含量＞料水比，其中麸皮和玉米粉比例对分生孢子数影响最大。按表2中最佳培养基组成做验证实验，分生孢子数为12.9×109CFU/g。

2.4 培养条件单因素实验 培养条件单因素实验结果如表3所示。接种量过低或过高都不利于淡紫拟青霉的产孢，接种量为6%时，分生孢子数最高，为 11×109CFU/g。淡紫拟青霉在温度为20～30℃范围内都能较好地生长，培养温度为25℃时最有利于其产孢，分生孢子数为11.7×109CFU/g。随着培养时间的增加，淡紫拟青霉的分生孢子数也随之增加，当培养时间为8 d时，分生孢子数到达最高，为11.8×109CFU/g，而培养时间继续增加，分生孢子数略为降低。

表3 培养条件单因素实验结果

2.5 培养条件正交实验 培养条件的正交实验结果如表4所示。

表4 培养条件正交实验结果

由表4可知，培养条件的最佳组合为A2B2C3，即接种量6%，培养温度25℃，培养时间为9 d，分生孢子数为13.5×109CFU/g。由极差值R分析可知，影响分生孢子数的因素顺序为A＞B＞C，即接种量＞培养温度＞培养时间，其中接种量对分生孢子数影响最大。按表4中最佳培养条件做验证实验，分生孢子数为13.5×109CFU/g。

3 讨论

淡紫拟青霉固体发酵对营养物质要求不高，发酵培养基的组成多以农副产品为主，例如麸皮、玉米粉、米糠等，原料易得，生产成本较低，同时又能为淡紫拟青霉的生长产孢提供有利养分［11－12］。本实验通过对发酵培养基的基质的筛选发现，以麸皮和玉米粉组成复合培养基比较适宜淡紫拟青霉生长，在麸皮中添加适量的玉米粉能够促进淡紫拟青霉的产孢，过量的玉米粉会使培养基结块，影响培养基的通气性，不利于淡紫拟青霉的生长。黄永兵［13］的研究也表明含玉米粉的培养基有利于淡紫拟青霉的生长。在淡紫拟青霉固体发酵中，料水比对产孢有较大的影响，料水比过大时，培养基含水量少，不利于淡紫拟青霉的孢子萌发，而料水比过小时，培养基含水量大，会因供氧不足而影响淡紫拟青霉的生长。本实验的结果表明，料水比为1∶0.6时，最有利于淡紫拟青霉产孢，这与谷军［14］的研究结果相一致。无机盐对淡紫拟青霉固体发酵有重要的影响，添加适合的无机盐能够促进孢子萌发，本实验研究表明，添加氯化锰能促进淡紫拟青霉产孢，汪军［15］的研究也表明添加锰离子能提高淡紫拟青霉的产孢量。培养基的初始pH值也会影响淡紫拟青霉的产孢，偏酸或偏碱都不利于其生长，中性环境下比较适宜其生长。接种量对固体发酵有着较大的影响，接种量过小时，不能满足菌种萌发需要量，淡紫拟青霉生长缓慢产孢量少，接种量过大时，不利于菌体对营养的有效利用，淡紫拟青霉产孢量也会降低。温度也是影响淡紫拟青霉产孢的重要因素，温度升高有利淡紫拟青霉的产孢，但固体发酵为放热过程，温度过高会将培养基内的菌落烧死，本实验结果表明淡紫拟青霉适宜的发酵温度为20～30℃，在25℃时生长最好。淡紫拟青霉固体发酵时间在8～10 d时，孢子产量较高，继续增加培养时间，淡紫拟青霉代谢能力减弱，孢子产量开始下降。本实验对淡紫拟青霉固体发酵条件进行了初步研究，旨在为淡紫拟青霉固体发酵的工业化生产提供参考，下步需要对淡紫拟青霉固体发酵的放大实验条件下相关参数进行探索，最终实现淡紫拟青霉固体发酵的工业化生产。

4 结论

本实验对淡紫拟青霉固体发酵条件进行了初步研究，通过单因素实验和正交实验对固体发酵培养基的组成及培养条件进行了优化，淡紫拟青霉固体发酵最佳的培养基组成为麸皮和玉米粉4∶1、料水比 1∶0.6、氯化锰含量 0.6%、初始 pH 值为6.0，固体发酵最佳的培养条件为接种量6%，培养温度25℃，培养时间为9 d，在此条件下淡紫拟青霉固体发酵的分生孢子数为13.5×109CFU/g。

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