超声—乙醇法提取血红铆钉菇子实体总黄酮工艺研究

赵聪+陈贵堂+王海翔+杨志萍+程抒劼+綦国红

摘要：通过单因素试验和正交试验优化了超声-乙醇法提取血红铆钉菇（Chroogomphus rutilus）子实体中总黄酮的工艺。结果表明，血红铆钉菇中总黄酮最佳提取条件为70%乙醇，料液比1∶30（m/V），超声时间30 min，最佳工艺条件下总黄酮提取率为5.91%。

关键词：血红铆钉菇（Chroogomphus rutilus）；超声；总黄酮；提取

中图分类号：TQ463+.24；R284.2；S646.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1309-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.028

Extraction Process of Total Flavonoid from Chroogomphus rutilus

by Ultrasonic Wave-Ethanol

ZHAO Cong， CHEN Gui-tang， WANG Hai-xiang， YANG Zhi-ping， CHENG Shu-jie， QI Guo-hong

（School of Engineering， China Pharmaceutical University， Nanjing 211198，China）

Abstract： The extraction process of total flavonoid from Chroogomphus rutilus fruit bodies was optimized by single factor and orthogonal experiments using ultrasonic wave-ethanol. With rutin as reference substance，the total flavonoid content was determined using aluminum nitrate colorimetric method. The optimal extraction conditions was ethanol concentration 70%，solid-liquid ratio 1∶30（m/V） and the ultrasonic time 30 min. The extraction yield of total flavonoid was up to 5.91% under the optimum conditions.

Key words： Chroogomphus rutilus； ultrasonic wave； total flavonoid； extraction

血红铆钉菇（Chroogomphus rutilus）为菌根性食用菌，即生于土壤并与树木形成外生菌根的食用菌[1]。属于担子菌亚门伞菌目铆钉菇科铆钉菇属[2]，主要生长于北温带[3]。东北地区俗称红蘑、松树伞、松蘑等[4]。子实体散生、群生或单生[5]，人工培养较为困难[1]。血红铆钉菇肉质鲜美，营养价值高，富含蛋白质、糖类、酚类及黄酮类化合物，具有抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、神经元保护[8]等多种药理活性，深受人们的喜爱。近年来对血红铆钉菇的研究多集中在多糖和蛋白质成分方面，而对其次生代谢产物黄酮类化合物研究鲜见报道。黄酮类化合物广泛存在于蔬菜水果中，各种体内体外试验表明黄酮具有多种生物学活性，如抗氧化[9，10]、抗肿瘤[11-13]、抗炎[14]和雌激素样作用等[15，16]。黄酮提取是其功能研究的第一步，但目前未见血红铆钉菇中总黄酮提取工艺的研究报道。

总黄酮的提取一般采用醇提法，但此方法耗时长且提取率不高[17]。本试验采用超声-乙醇提取法，以总黄酮提取率作为指标，探究血红铆钉菇中总黄酮最佳提取工艺，以期对该食用菌中总黄酮的研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

血红铆钉菇购于辽宁朝阳，洗净烘干后用中药粉碎机粉碎，过60目筛。芦丁标准品，购于上海金穗生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司；Tu-1990/Tu-1991型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂；GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FA-N/JA-N型系列电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；JY92-ⅡN型超聲波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制作 将芦丁标准品120 ℃烘干至恒重，准确称取10 mg，用70%乙醇等比例稀释成浓度为0～100 μg/mL的混合溶液。分别取1 mL各浓度下的芦丁溶液，先后加入1 mL 70%乙醇溶液和0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min，再加入0.3 mL 10%的硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min，最后再加入4%的氢氧化钠溶液2 mL，摇匀，静置10 min。用70%乙醇溶液作空白对照，在波长510 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线。线性回归方程为y=0.002 5x-0.004 8，R2=0.998 9。

1.3.2 血红铆钉菇中总黄酮含量的测定 称取血红铆钉菇粉1 g，按一定的料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，搅拌均匀后静置30 min。冰浴条件下，超声处理一段时间，4 000 r/min离心10 min，取上清液，定容至100 mL。取1 mL溶液定容至10 mL，按“1.3.1”中的方法进行测定。根据公式计算总黄酮提取率。总黄酮提取率=总黄酮含量（g）/血红铆钉菇干粉质量（g）×100%。

1.3.3 总黄酮提取率单因素试验与正交试验 对影响超声波提取血红铆钉菇中总黄酮的超声时间、料液比、乙醇体积分数进行单因素试验和正交试验，确定最佳提取工艺。正交试验因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 超声时间对血红铆钉菇总黄酮提取率的影响

在料液比为1∶30（m/V，下同），乙醇体积分数为50%，超声功率为200 W的条件下，分别以超声时间10、20、30、40、50 min对血红铆钉菇进行处理，结果如图1所示。由图1可知，超声时间在30 min时总黄酮提取率最高。超声处理有利于细胞破壁，超声处理时间低于30 min时，超声时间越长，提取率越高。但随着超声时间的延长，体系温度升高，导致总黄酮分解或氧化，而且随着超声处理时间的延长，溶剂挥发量增加，不利于总黄酮提取，所以超声处理超过30 min后提取率下降。而且，随着超声时间的增加，其他醇溶性杂质的溶出量随之增加，对总黄酮测定造成干扰，这也是50 min处理时提取率高于 40 min的原因。

2.2 料液比对血红铆钉菇总黄酮提取率的影响

在超声处理时间为30 min，乙醇体积分数为50%，超声功率为200 W的条件下，料液比分别为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50进行提取，结果见图2。由图2可知，料液比为1∶20时血红铆钉菇总黄酮提取率最高，之后随着溶剂量增加，提取率反而下降，可能是随着溶剂用量增加其他醇溶性杂质溶出率也随之增加，影响总黄酮的提取，从而使总黄酮提取率降低。

2.3 乙醇体积分数对血红铆钉菇总黄酮提取率的影响

在超声时间为30 min，料液比为1∶20，超声功率为200 W的条件下，不同乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响如图3所示。由图3可知，乙醇体积分数为70%时，总黄酮提取率最高。黄酮类化合物为脂溶性物质，增加乙醇体积分数总黄酮溶解度随之增加，从而使提取率增加。但随着乙醇体积分数的增加，溶剂挥发量增加，而且其他醇溶性杂质的溶出也会增加，从而导致提取率下降。

2.4 正交试验结果

根据单因素试验结果，进行L9（34）正交试验，结果见表2。根据极差分析可以得出，各因素对血红铆钉菇总黄酮提取效果的影响主次顺序为C>B>A，即乙醇体积分数>料液比>超声时间。由正交试验结果可知，总黄酮最佳提取条件为乙醇体积分数70%，料液比1∶30，超声提取时间30 min。

2.5 验证试验

按照正交试验所得最佳提取条件进行验证试验，得到血红铆钉菇总黄铜平均提取率为5.91%。试验表明，最佳提取工艺是可行的。

3 小结

通过单因素试验和正交试验，确定了超声-乙醇法提取血红铆钉菇子实体中总黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数70%，料液比1∶30，超声时间30 min。最佳工艺条件下，总黄酮提取率为5.91%。

参考文献：

[1] 栾庆书.血红铆钉菇研究现状及开发利用[J].食用菌，2002（2）：2-3.

[2] 李贞卓，包海鹰.血红铆钉菇化学成分和药理活性研究概述[J]. 菌物研究，2015，13（3）：181-186.

[3] 陈添兴.南京紫金山大型菌物多样性研究[D].南京：南京师范大学，2012.

[4] 戴玉成，图力古尔.中国东北野生食药用真菌图志[M].北京：科学出版社，2007.

[5] 李 华，卫 敏，薛龙龙，等.血红铆钉菇子实体中化学成分类型及多糖含量[J].食用菌学报，2011，18（4）：67-68.

[6] 唐 超，王清吉，葛 蔚，等.血红铆钉菇多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用[J].安徽农业科学，2010，38（6）：2966-2967.

[7] GAO C J，WANG Y H，WANG C Y，et al. Antioxidant and immunological activity in vitro of polysaccharides from Gomphidius rutilus mycelium[J].Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：2187-2192.

[8] 张雪倩，孙 红，王立安，等.色钉菇粗多糖对小鼠DA能神经元MPTP损伤的保护作用[J].菌物学报，2011，30（1）：77-84.

[9] 周晓丽，邵 震，李婷婷，等.木瓜黄酮的提取及抗氧化性研究[J].食品工业科技，2007，28（8）：170-172.

[10] 方玉梅，谭 萍，王毅红，等.金针菇黄酮类化合物清除DPPH自由基活性[J].食品研究与开发，2012，33（7）：8-10.

[11] 崔誉蓉，李德芳，鞠 寶，等.四种甘草黄酮类化合物体外抗肿瘤作用研究[J].食品科技，2010，35（7）：88-92.

[12] 张明发，沈雅琴.甘草粗提物及其黄酮类成分的抗肿瘤作用[J].现代药物与临床，2010，25（2）：124-129.

[13] 向明钧，周卫华，彭 霞，等.茶树花黄酮类物质抗肿瘤作用研究[J].食品工业科技，2013，34（12）：157-160.

[14] SINGH M，KAUR M，SILAKARI O. Flavones：An important scaffold for medicinal chemistry[J].European Journal of Medicinal Chemistry，2014，84：206-239.

[15] 汪远金，许金林，张 杰，等.大豆异黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松症的实验研究[J].食品科学，2003，24（2）：120-122.

[16] 朱瑞清，葛宝丰，陈克明，等.金雀异黄酮与芹菜素的雌激素样作用体外研究[J].中国中药杂志，2012，37（15）：2318-2332.

[17] 王毓宁，陈和平，冯作山.超声波-乙醇法提取芦蒿总黄酮的工艺研究[J].江苏农业科学，2007（5）：215-217.