响应面法优化莴笋废弃物叶绿素提取工艺试验

付晶晶+唐昭+关红艳+程雅芳+孙健

摘要：【目的】莴笋废弃物中含有丰富的天然叶绿素，利用莴笋废弃物提取叶绿素，提高莴笋废弃物利用价值，同时为叶绿素提取原料开拓新的资源。【方法】在单因素试验基础上，选取提取时间、液固比、提取温度、转速为自变量，叶绿素得率为响应值，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理采用4因素3水平的响应面分析法，研究各自变量及其交互作用对叶绿素提取量的影响，得到二次多项式回归方程的预测模型。【结果】通过软件分析，本试验回归模型预测莴笋废弃物叶绿素提取的理论最佳工艺条件为：提取时间56.66min，液固比13.71mL/g，提取温度43.35℃，转速152.18rpm，在此条件下，叶绿素理论得率可达0.7706mg/g。验证试验，得到实际叶绿素得率为0.7665mg/g，与理论值相比，其相对误差为0.53%。【结论】最佳提取工艺条件为：提取时间57min，液固比14mL/g，提取温度43℃，转速150rpm。在此条件下叶绿素实际得率为0.7665mg/g，与预测值0.7706mg/g相对误差为0.53%。

关键词：莴笋废弃物；叶绿素；提取；响应面法

中图分类号：TS209 文献标识码：A 文章编号：1003-4374（2016）05-0019-06

Abstract：【Objective】The discarded parts of lettuce are rich in natural chlorophyll， and extraction of chlorophyll from lettuce discarded parts can not only beneficial for utilization of waste resources but also play a positive role on environment protection and economic benefit. 【Method】Response surface methodology （RSM） combined with single factor experiments were employed to maximize chlorophyll extraction yield based on Box-Behnken central composite design involving 4 factors （extraction time， liquid/solid ratio， temperature and rotate speed） at 3 levels. The interaction of the respective variables and their influence on the chlorophyll extraction yield were studied， and the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model was set up. 【Result】The results showed that the optimal condition for extraction of chlorophyll was that the extraction time of 57min the liquid/solid ratio of 14mL/g， the extraction temperature of 43℃， and the rotate speed of 150rpm. Under this condition， the measured extraction yield of chlorophyll was 0.7665mg/g， and the relative error was 0.53% compared with the theoretical value of 0.7706mg/g. 【Conclusion】The optimized extraction process parameters can provide a reference for industrial production of chlorophyll from lettuce discarded parts.

Key words： lettuce discarded parts； chlorophyll； extraction； Response Surface Methodology

我國是蔬菜大国，随着蔬菜产量提高，蔬菜废弃物的产生也急剧上涨。有研究表明，蔬菜产物：摄取量为1：0.7，即30%的蔬菜成为了废弃物。据国家统计局统计，2014年我国蔬菜产量76005.48万吨，理论上蔬菜废弃物高达22802万吨，直接经济损失2343亿余元。另外，按生活垃圾处理总成本费用150元/吨算，我国2014年蔬菜废弃物垃圾处理费理论上近1140亿元。因此，对蔬菜废弃物的回收利用，不论在环境保护还是经济成本核算上都具有重要意义。

莴笋是菊科莴笋属草本植物，是一种常见的蔬菜，但由于人们的饮食习惯，仅食用去除叶、皮之外的肉质部分，而占莴笋整体40%左右的叶、皮一般会被扔掉。调查仅广西南宁淡村农贸市场一个普通摊位每天丢弃掉的莴笋废弃物就达30kg左右。这些废弃物含水量很高，如果按生活垃圾处理成本巨大，同时对环境造成污染。因此，对莴笋废弃物的回收利用显得尤为重要。莴笋叶中富含叶绿素，叶绿素广泛存在于绿色植物中，是一种天然色素，安全无毒[1]，广泛应用于食品及化妆品领域[2]。叶绿素还具有抗氧化、抗突变、除臭等多种生理功能，在预防慢性疾病方面发挥积极作用。近年来，也有研究表明，叶绿素有抑制肿瘤细胞的作用[3]。目前，对叶绿素提取工艺已有不少报道，如西洋菜[4]，野葛[5]，大麦苗[6]，蚕沙[7]，菠菜[8]等。但经检索还未见对莴笋叶、皮中叶绿素提取开发的相关研究。本试验利用莴笋废弃物提取叶绿素，应用响应面分析法优化工艺，希望能够提高莴笋废弃物利用价值，同时为叶绿素提取原料开拓新的资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莴笋废弃物：2015年08月于广西南宁淡村农贸市场取得，新鲜原料经匀浆机粉碎后于-20℃贮藏备用。95%乙醇（分析纯）。

1.2 仪器与设备

UV-9100紫外可见分光光度计（北京瑞利）；TDL-5-A离心机（上海安亭）；TS-110X30恒温水浴摇床（上海科辰）。

1.3 方法

1.3.1 叶绿素测定 试验采用分光光度法测定叶绿素含量，主要是以Arnon计算法为基础。叶绿素提取量的计算公式如下[9]：

叶绿素含量（mg/g）=式中：A645—样品稀释液在波长645nm时的吸收度；A663—样品稀释液在波长663nm时的吸收度；n—稀释倍数；V—样品溶液体积，mL；m—样品质量，g。

1.3.2 莴笋废弃物中叶绿素提取方法 称取一定量（按不同液固比加入不同质量）样品，置于100mL具塞三角瓶中，加入40mL95%乙醇，在一定温度、时间及恒温培养振荡器转速下提取。收集提取液，提取液于4500rpm离心5分钟，稀释5倍（全部试验过程在弱光下进行）。离心后提取液由分光光度计分别于645nm、663nm处测出提取液的吸光度，根据公式计算出叶绿素的得率。

1.3.3 单因素实验 固定其它因素不变，分别取不同提取时间、液固比、温度、转速进行实验，测定其吸光度值，计算叶绿素得率，每组实验重复三次。利用单因素实验得到各因素的较优水平进行响应面实验。

（1） 提取时间对叶绿素得率的影响。液固比为 10：1（mL/g）、30℃，静态提取，提取时间为20、30、40、50、60、70min。

（2）液固比对叶绿素得率的影响。提取时间为60min、30℃，静态提取，液固比分别为5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1（mL/g）。

（3）提取温度对叶绿素得率的影响。液固比为10：1（mL/g）、提取时间60min，静态提取，提取温度为20、30、40、50、60℃。

（4） 提取转速对叶绿素得率的影响。在液固比为 10：1（mL/g）、提取时间为60min、30℃，转速为0、50、100、150、200rpm。

1.3.4 响应面法优化实验 根据单因素实验结果，选取每个单因素实验中较优的水平进行设计，对四因素三水平共29个试验点（5个中心点）进行响应面分析试验，以1，0，-1代表各因素的高、中、低水平。运用Design-Expert软件对试验数据进行回归分析，对提取条件进行优化。表1为响应面试验设计表。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 提取时间对叶绿素得率的影响 由图1可知，提取时间在20～40min时，叶绿素得率随着时间的增加上升较快，当提取时间大于40min后，叶绿素得率虽有增加，但速度减缓。这可能是由于短时间内叶绿素的溶出会随着时间的增加而增多，但是再增加时间叶绿素的浸出达到平衡，叶绿素得率也不会有明显的改变。由于时间过长，成本相对高，因此，选取提取时间为40、50、60min 3个水平，进行响应面试验。

2.1.2 液固比对叶绿素得率的影响结果 通过图可2以看出，当液固比低于10∶1（mL/g）时，叶绿素的得率随着液固比的增加增大较快，继续增加液固比，大于10∶1（mL/g）时，叶绿素得率虽有增加，但增大趋于平缓；这可能是由于液固比较低时，增加液固比可增加传质动力，有助于乙醇对叶绿素提取，但当液固比继续增大，大部分叶绿素都已溶出时达到平衡时，叶绿素得率增加缓慢[6]。考虑叶绿素的得率，同时考虑工业化生产的成本问题，液固比越大成本越高，因此选择液固比5∶1、10∶1、15∶1（mL/g）3个水平值，进行响应面试验。

2.1.3 提取温度对叶绿素得率的影响 由图3可以看出，提取温度较低时（20～30℃），随着提取时间的增加，叶绿素得率增加较快；当提取温度升高（30～50℃），随着提取温度的增加叶绿素得率增加逐渐减缓；当温度超过50℃时，叶绿素得率不再上升，甚至出现下降。可能是由于随着温度升高，分子运动加剧，从而加速乙醇对莴笋废弃物中叶绿素的溶出，使叶绿素得率增加[10]。但若温度继续上升，由于叶绿素对热不稳定，在高温下叶绿素易被分解，所以叶绿素得率不会继续上升，甚至下降[11]。根据单因素实验，选取提取温度为30℃、40℃、50℃，3个水平值进行响应面试验。

2.1.4 转速对叶绿素得率的影响 通过图可4以看出，当转速较低（0～150rpm）时，随着转速的增加，叶绿素的得率不断增大；当转速大于150转时，叶绿素的得率几乎不再增加。因此选择转速100rpm、150rpm、200rpm3个水平值，进行响应面试验。

2.2 响应面分析法优化结果与分析

2.2.1 响应面分析方案及结果 在单因素实验的基础上，得出影响莴笋废弃物中叶绿素得率的四个影响因素，以提取时间（A）、液固比（B）、提取温度（C）、转速（D）为响应因子，每个因素取三个较优水平，进行响应面分析实验，实验方案及实验结果见表2。

利用Design-Expert8.0.5软件对所得的实验数据进行回归分析，得到莴笋废弃物叶绿素得率（Y）对各因素的回归模型方程：

Y=0.75++0.014A+0.043B+0.007175C+0.006583D+0.001650AB-0.003175AC+0.000125AD+0.0002500BC-0.006525BD-0.003150CD-0.010A2-0.032B2-0.008467C2-0.017D2

由于該方程为二次方程，二次项系数均为负值，即代表的方程图像的抛物面开口向下，具有极大值，可以进行优化分析[12]。

2.2.2 回归方程的方差分析及系数显著性分析 表3为回归方程的方差分析和显著性检验，可以看出，F值=22.18，P值<0.0001，说明该模型是有效可靠的，达到极显著水平，有意义。失拟项的P值为0.0629>0.05，不显著，表明对模型有利。模型项A、B、B2、D2都达到极显著水平，C、D、A2达到显著水平。F值及回归模型方程的一次项系数均可判断影响莴笋废弃物中叶绿素得率的主次顺序：液固比>提取时间>提取温度>转速[13]。R2=0.9569，说明该模型能解释95.69%响应值的变化，R2Adj=0.9137，说明可信度较高。C.V=1.44，较低，显示试验稳定性较好。

2.2.3 响应面分析与优化 通过Design Expert 8.0.5软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，以叶绿素得率为响应值的响应面图见图5～图10。

由图5、6、7当转速低于150转左右时，随着转速的增加，叶绿素的得率不断增大；当转速大于150转时，叶绿素的得率几乎不再增加。由图5、8、10当提取时间55分钟时，叶绿素的得率达到最高值。由图6、8、9当提取温度达43℃左右时，叶绿素的得率达到最高值。温度继续增高，叶绿素的得率下降。由图7、9、10随着液固比的增加，叶绿素的得率不断增加，但液固比为13以上时，得率增加缓慢，出于成本考虑，不会无限增加液固比。

通过软件分析得本试验回归模型预测莴笋废弃物叶绿素提取的理论最佳工艺条件为：提取时间56.66min，液固比13.71mL/g，提取温度43.35℃，转速152.18rpm，在此条件下，叶绿素理论得率可达0.7706mg/g。为检验响应面法所得结果的可靠性，对上述条件进行验证试验。考虑到实际操作的方便性，将最优工艺条件调整为提取时间57min，液固比 14mL/g，提取温度43℃，转速150rpm，通过3组平行实验进行验证，求其平均值，得到实际叶绿素得率为0.7665mg/g，与理论值相比，其相对误差为0.53%。与预测值基本相符，说明模型准确可靠，具有实用价值。

3 结论及展望

本试验以莴笋在食用过程中的废弃物为原料提取叶绿素，在单因素试验的基础上采用响应面设计实验，选取四因素三水平共29个试验点（5个中心点）进行响应面分析试验，建立了二次多项式数学模型，优化了莴笋废弃物中叶绿素的提取工艺。确定其最佳提取工艺条件为：提取时间57min，液固比 14mL/g，提取温度43℃，转速150rpm。在此条件下叶绿素实际得率为0.7665mg/g（鲜重），与理论值基本相符，说明模型准确可靠，得到的回归方程可较好地预测试验结果。试验中所用原料为新鲜原料，已测莴笋中水分含量为94.6%，估算干重得率为14.19mg /g。叶绿素得率略高于其他已经报道的植物中叶绿素含量，如菠菜[14]（0.682mg/g，鲜重），芹菜[1]（9.796mg/g，干重），大麦苗[6]（13.622mg/g，干重），野葛叶[5]（6.91mg/g，干重）。本试验能够提高莴笋废弃物利用价值，同时由于试验过程中原料莴笋未干燥处理，一定程度是节约了能源，为进一步开发利用莴笋废弃物资源提供了科学的理论依据，同时为叶绿素提取原料开拓了新的资源。

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