EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

杨铭，胡晓星，王文广，张莉，董书维，冯悦，代解杰*，夏雪山*

(1. 昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500；2. 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩标准化研究与疾病动物模型创建省创新团队，昆明 650118)

研究报告

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

杨铭1，胡晓星1，王文广2，张莉1，董书维1，冯悦1，代解杰2*，夏雪山1*

(1. 昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500；2. 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩标准化研究与疾病动物模型创建省创新团队，昆明 650118)

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ～ 96 h病毒滴度可达到1.3×106TCID50/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ～ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ～ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。

树鼩原代肾细胞；EV71；病毒增殖；VP1蛋白；感染模型

人肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是导致人手足口病的主要病原体之一，主要感染人群为5岁以下的婴、幼儿，重症感染可引发严重的中枢神经系统和心肺系统并发疾病，严重威胁人类健康[1]。目前，尽管已有可预防EV71感染的疫苗上市，仍需要建立合适的手足口病动物模型，用于病毒感染后致病机制研究和药物研发。现有的EV71感染动物模型主要为幼龄小鼠或乳鼠、免疫缺陷小鼠，以及非人灵长类的食蟹猴、恒河猴[2, 8]。

树鼩(Tupaiabelangeri, tree shrew)是一种属于攀鼩目的小型哺乳动物，主要分布于南亚，东南亚以及中国的西南地区。作为一种与灵长类亲缘关系较近的新型实验动物[3-5]，其体型较小、繁殖周期短、成本较低以及在生理解剖方面和灵长类高度相似等特点，现已被用于建立了多种人类病毒性疾病的动物模型[6]，如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎(HCV)和单纯疱疹病毒(HSV)等[7]。2012年，王文广等[8]发现EV71能够感染幼龄中缅树鼩，在手掌、口鼻除出现水泡等典型的手足口病症状，初步证实树鼩可以作为EV71手足口病的疾病动物模型。

在建立病毒感染动物活体模型的同时，建立合适的动物感染细胞模型，对于EV71感染与致病机制的深入研究，以及体外药物筛选与评价都至关重要。目前，与EV71相关的体外感染及其机制的深入研究都以细胞系作为主要工具，在与活体机能更为相似的原代细胞上开展的研究较少报道。本研究在EV71可以感染树鼩活体，认为树鼩可以作为EV71病毒感染模型的基础上，分离培养树鼩的原代肾细胞，确定EV71病毒对其感染与增殖特性，探索建立EV71感染树鼩原代肾细胞模型，并为建立EV71感染树鼩手足口病模型提供必要的佐证。

1 材料与方法

1.1 实验动物与EV71病毒株

经人工繁育的清洁级，4月龄F1代雄性中缅树鼩1只，体重145 g，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心【SCXK(滇)2013-0001】繁育。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料，饲养和实验操作在昆明理工大学实验动物中心。EV71标准株(2010FJLY008)，来自中国典型培养物保藏中心，以Vero细胞进行培养，测定其滴度为1.1×105TCID50/mL。

1.2 树鼩原代肾上皮细胞的培养与鉴定

树鼩腹腔注射苯巴比妥进行麻醉，解剖取出双侧肾脏，用含青链霉素的D-Hank’s清洗3次，去除肾蒂及包膜，用眼科剪将其剪成1 mm3左右的颗粒状，转移至含0.25 %的胰蛋白酶消化液中，37℃孵育1 h，每隔10 min振荡30 s。消化1 h后用100目的网筛过滤，去除组织块后加入完全培养基(10% FBS + 90% RPMI 1640)中和胰酶，1000 r/min离心15 min离心洗涤3次，获得树鼩原代肾细胞。用含有5 ng/mL表皮生长因子(EGF，购自Pepro Tech)的RPMI 1640完全培养基(10% FBS + 90% RPMI 1640)，5% CO2、37℃培养细胞，每2 d换一次培养基，并根据细胞生长状况进行胰酶消化传代。

根据原代肾细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感度差异以及细胞贴壁的时间不同，对分离得到的原代肾细胞进行纯化，经2次传代培养即可获得较纯的肾细胞。用角蛋白18(CK18)抗体(Abcam公司)和荧光二抗(goat anti-mouse FITC)对树鼩肾细胞进行免疫荧光检测，确定肾上细胞的比例与纯度。

1.3 EV71病毒感染树鼩原代肾细胞与病毒增殖情况测定

按感染复数为0.1(MOI=0.1)的EV71病毒感染Vero细胞，维持培养至36 h时收取培养上清，为用于感染树鼩原代肾细胞的EV71病毒液。以感染复数为2(MOI=2)的EV71病毒接种原代树鼩肾细胞，同时设Vero细胞作为阳性对照，在培养箱中孵育2 h后去除上清，使用PBS洗6次，以最后一次洗液作为0 d对照。

用完全培养基培养感染病毒的细胞，每12 h收集一次病毒上清，提取上清中的核酸，一步法RT-PCR检测病毒核酸(TaKaRa One-Step RT-PCR Kit)，上游引物VP1-F2：GCCTATATAATAGCACTAGCGGCAG，下游引物VP1-R2：TTGACC ACTCTAAAGTTACCCACAT，扩增片段为507 bp)。TaqMan荧光定量PCR法检测上清中的病毒载量(TaKaRa One-Step PrimeScript RT-PCR Kit)，上游引物：EvF1(474-493 bp)-TGGAGCCCCTAAGCCAGATT，下游引物EvR1(577 - 596 bp)-CTCGCAGGTGACATGAATGG，探针序列为：TaqMan Probe(504 - 528 bp)：CCTTGCATGGCAAACCGCCACTAAC。

1.4 EV71病毒滴度检测

注：红圈部分表示纤维细胞。图1 树鼩原代肾上皮细胞的培养、纯化及鉴定(10×10)Note.The red circles represent the fibrocytes.Fig.1 Culture, purification and identification of the primary renal epithelial cells from tree shrew

将Vero细胞以5×103的密度接种到96孔板中，取收获的病毒上清50 μL，用无血清的DMEM培养基进行10倍梯度稀释，每个梯度设4个复孔。将稀释好的病毒接种到长成致密单层的Vero细胞中，每孔100 μL，正常细胞对照组中仅加入细胞培养液，37℃ 5% CO2培养箱中孵育2 h，弃去孵育液，加入含2.5 % FBS的DMEM培养基维持液，置于37℃ 5 % CO2培养箱中培养，显微镜下观察细胞病变(CPE)，直至CPE不再增加时(6～7 d)，按照Reed- Muench法计算病毒滴度(TCID50/mL)。

1.5 树鼩原代肾细胞中EV71 VP1的表达检测

Western blot 检测EV71 VP1蛋白。感染后1、2、4、6 d和8 d收集的树鼩原代肾细胞，及病毒感染与不感染Vero细胞，用RIPA裂解液(购自北京碧云天生物技术)提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量后，按上样量为20 μg进行SDS-PAGE电泳，转膜后用anti-mouse VP1一抗和HRP二抗(Abcam)进行细胞中EV71 VP1蛋白检测。

间接免疫荧光检测EV71 VP1蛋白在树鼩肾细胞中的表达。甲醇固定细胞病毒感染后1、2、4 d和6 d的树鼩原代肾上皮细胞，经anti-mouse VP1 一抗和 goat anti-mouse FITC二抗(Abcam)标记，荧光显微镜下检测被感染细胞中VP1蛋白的分布情况。

2 结果

2.1 树鼩原代肾细胞的分离培养及鉴定

用优化的培养条件对分离得到的树鼩原代肾细胞进行培养至第4 天，可显微观察到细胞形态呈现出不规则多边形，细胞间界限和轮廓较为清晰(图1-a)，细胞生长与增殖状况良好。传代纯化传至第2代时，培养细胞中存在较少的成纤维细胞(图b中红色圈所示)已几乎不见(图c)，角蛋白CK18抗体进行免疫荧光鉴定发现，大多细胞呈现出特异性绿色荧光，树鼩原代肾细胞的纯度达90 % 以上(图1d)。

注：(a)M. DL2000 Marker； 1. Vero细胞感染后培养上清； 2. Vero细胞洗液； 3. 树鼩原代肾细胞感染后培养上清； 4. 树鼩原代肾细胞洗液； 5. 未感染树鼩肾细胞培养上清。(b)0 h为洗液；ns为差异无显著性；**表示P<0.01，***表示P<0.001，差异有显著性。图3 EV71感染树鼩原代肾细胞和Vero细胞上清中病毒核酸检测Note. (a): M. DL2000 marker; 1, the culture supernatant of Vero cells after infection; 2, supernatant of the Vero cell after infection; 3, the culture supernatant of tree shrew primary renal cells after infection; 4, wash solution of the tree shrew primary renal cells; 5, cell culture supernatant of the tree shrew primary renal cells was not infected. (b): 0h is wash solution; ns represents non-significant differences; **P<0.01 and ***P<0.001 indicate significant differences. Fig.3 Detection of the EV71-infected primary renal cells of tree shrew and Vero cells

2.2 树鼩原代肾细胞培养与细胞增殖

对树鼩原代肾细胞维持培养至17 d，通过MTT法测定其细胞活力，绘制树鼩原代肾细胞增殖曲线(图2)，同时设Vero细胞作为对照进行比较。在优化培养条件下，树鼩原代肾细胞可有效增殖，线性增殖可至第10天达到细胞增殖平台期。培养前期树鼩原代肾细胞的增殖能力基本等同于Vero细胞系，培养至11～17 d的过程中，树鼩原代肾细胞增殖能力相比Vero细胞逐渐下降，至15 d开始明显下降，表明15 d以后树鼩原代肾细胞开始凋亡。

图2 树鼩原代肾细胞和Vero细胞培养增殖特性Fig.2 Proliferation of primary renal cells of tree shrew and Vero cells

2.3 EV71感染树鼩原代肾细胞与病毒增殖

Vero细胞接种EV71病毒后，培养36 h收取细胞上清，经测定上清中病毒滴度为1.1×108TCID50/mL。用培养得到的EV71病毒感染树鼩原代肾细胞和Vero细胞，最后一道洗液及感染48 h的培养上清，提取病毒核酸进行RT-PCR检测。如图3-a所示，Vero细胞和树鼩原代肾细胞的培养上清中都能检测到EV71的特异性目的条带，大小为507 bp，而洗液及阴性对照均未扩增出目的条带。

用实验室建立的荧光定量PCR(TaqMan探针法)法检测培养上清中的EV71病毒载量，感染树鼩原代肾细胞培养上清中病毒载量为106copies/μL，远高于洗液中残留的病毒量，但明显低于阳性Vero细胞产生的病毒量(图3-b)。据此结果，可初步确定EV71可以感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。

以最适感染复数的EV71病毒接种树鼩原代肾细胞，每隔12 h收取培养上清测定病毒载量和滴度，绘制EV71在树鼩原代肾上皮细胞中的增殖曲线(图4)。根据病毒在树鼩原代肾细胞增殖曲线知，病毒感染树鼩原代肾上皮细胞48 h内，上清中病毒载量与病毒滴度呈线性升高的趋势，48 ～ 96 h上清中病毒随着培养时间的延长缓慢上升，在96 h达到高峰，然后病毒载量仍可维持较高水平，但病毒滴度显著下降。通过观察细胞形态发现，病毒感染96 h时细胞已经开始凋亡，至192 h(8 d)时细胞几乎完全脱落。EV71感染树鼩原代肾细胞后的48 ～ 96 h期间病毒滴度最大，达到1.3×106TCID50/mL，进一步说明EV71病毒能够感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。

图4 EV71在树鼩原代肾细胞中的增殖曲线Fig.4 Proliferation curves of EV71 virus in the primary renal cells of tree shrew

2.4 EV71感染树鼩原代肾细胞中VP1蛋白表达

EV71感染树鼩原代肾细胞后不同时间收集感染上清与细胞，Western blot法检测被感染细胞内的病毒蛋白VP1。如图5所示，在感染后的第1天，未能检测到VP1蛋白，而在感染后2 ～ 8 d内均能够检测到特异性VP1蛋白条带。阳性对照Vero细胞在被感染后第2天的VP1蛋白最明显，然后4 ～ 8 d时处于同一水平，较第2天弱一些。未感染的树鼩原代肾上皮细胞(negative)未检测到VP1蛋白。

免疫荧光法检测EV71感染树鼩原代肾细胞后VP1蛋白在细胞内表达情况。观察发现，在感染后的第1天，并未检测到明显的用于标记VP1蛋白的绿色荧光反应，而只能见到DAPI复染细胞核的蓝色荧光，说明病毒还未发生明显的复制活动。从感染后第2 天开始至第6 天均能检测到明显的绿色荧光，主要围绕在细胞核的外周质中，说明EV71的VP1蛋白主要表达于被感染细胞的细胞质中，这一现象和EV71 感染Vero细胞(4 d)后的现象相同，标记VP1蛋白的绿色荧光分布于细胞核周围的胞质中。未感染的树鼩原代肾上皮细胞未检测到绿色荧光，只能见到DAPI复染的细胞核。

WB检测与免疫荧光观察结果均表明，EV71病毒能够感染树鼩原代肾细胞，并且在细胞内有效增殖，VP1蛋白主要存在于细胞质中。

图5 Western blot检测EV71 VP1蛋白在树鼩原代肾上皮细胞中的表达Fig.5 Expression of EV71 VP1 protein in the tree shrew primary renal cells detected by Western blot

图6 免疫荧光检测EV71 VP1在树鼩原代肾上皮细胞中的表达(10×10)Fig.6 Immunofluorescence detection of EV71 VP1 protein in the tree shrew primary renal cells

3 讨论

当前EV71感染的动物模型研究主要是以幼龄、免疫缺陷或基因修饰小鼠以及恒河猴作为对象，但小鼠在遗传和亲缘关系上与人相对较远，而非人灵长类的恒河猴成本较高。树鼩作为一种低等灵长类动物，因其与人类的亲缘关系较近、成本低、繁育周期短等优点，现已被运用于人类相关重大疾病的研究[7,9,10]。在王文广等[8]关于幼龄树鼩能够感染EV71的实验基础上，本实验采用树鼩的原代肾上皮细胞进行EV71体外感染特性的研究。对于原代肾上皮细胞的分离培养已有文献报道，而本实验采用的是张丽娇等[11]报道的胰酶消化法来获取树鼩的原代肾上皮细胞，通过优化培养条件得到了较纯的树鼩原代肾上皮细胞，并通过角蛋白CK18鉴定[12，13]。通过比较Vero细胞系和树鼩原代肾上皮细胞的生长特性，发现树鼩原代肾上皮细胞和Vero细胞在15 d以内可由对数生长期至平台期，并能在对数期维持一定的生长活力，由此说明树鼩原代肾上皮细胞能够充分满足体外EV71感染实验的条件。

通过EV71对树鼩原代肾上皮细胞和Vero细胞感染48 h后的核酸以及培养上清病毒载量的测定，结果是在感染树鼩原代肾上皮细胞的培养上清中能明显检测到了病毒的扩增条带，这和阳性对照的Vero细胞结果一致。并且再测定两种细胞培养上清中的病毒载量时发现没有存在显著性的差异，且都要明显地高于0 h的洗液，初步确立了EV71能够较好地感染树鼩原代肾上皮细胞，并且病毒能够在细胞内进行复制过程。为了进一步确定EV71在被感染细胞内的感染和复制活动，本研究通过Western blot和免疫荧光分别检测了细胞内的EV71病毒蛋白VP1和定位情况。比较树鼩原代肾上皮细胞和Vero细胞的结果，其能够证明和Vero细胞一样，在经EV71感染2 d后开始，此后在不同时间段均能检测到VP1蛋白的持续存在，这和免疫荧光的检测结果相吻合，说明EV71在感染树鼩原代肾上皮细胞后的6 ～ 8 d内，病毒可持续存在并活动。

通过本研究，我们成功分离并优化了树鼩原代肾上皮细胞的培养条件，得到较纯且生长状态良好的原代肾上皮细胞，进而成功建立了EV71的树鼩体外细胞感染模型。在进行树鼩的原代肾上皮细胞感染后，通过系统地评价其感染特性，根据被感染细胞中病毒的核酸和蛋白层面检测结果，均能够证明EV71可以感染树鼩体外的原代肾上皮细胞，其特征和Vero细胞相符。以上这些研究成果能够为后继进一步深入的研究EV71的体外感染机制奠定基础。同时，EV71对树鼩体外感染模型的建立为将来细胞层面的药物筛选提供了平台，进而也为树鼩活体感染模型的研究提供必要的依据。

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Establishment of a EV71 virus infection model of tree shrew primary renal cells

YANG Ming1，HU Xiao-xing1，WANG Wen-guang2，ZHANG Li1， DONG Shu-wei1， FENG Yue1，DAI Jie-jie2*，XIA Xue-shan1*

(1. Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China;2. Yunnan Provincial Innovation Group of Tree Shrew Standard Culture and Animal Model, Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Kunming 650118)

Objective To establish an enterovirus 71 (EV71) infection model of tree shrew primary renal cells. Methods Tree shrew primary renal cells were obtained by trypsin digestion. After subculture and purification, EV71 virus was used to infect these primary cells. The culture supernatant of these EV71-infected cells was collected for virus titer detection at 1, 2, 4, 6 and 8 days post-infection. The cells were collected for detection of EV71 VP1 protein by Western blot assay. Furthermore, the expression and location of VP1 protein in the infected cells were detected by indirect immunofluorescence assay. Vero cells were taken as positive control to evaluate the infectivity of EV71 virus to tree shrew primary renal cells. Results Morphologically, the cultured cells were proved to be majorly consisted of the primary renal cells after subculture and purification. The obtained primary cells were infected by EV71 virus. The virus titer was up to 1.3 × 106TCID50/mL during 48-96 h post-infection, proving that EV71 virus infected and proliferated in the tree shrew primary renal cells. Western blot showed that the viral VP1 protein was detected from infected primary cells at 2 to 8 d post infection. VP1 protein was also observed in the cytoplasm at 2 to 6 d post infection by indirect immunofluorescence. Compared with Vero cells, the infectivity of EV71 virus to tree shrew primary renal cells and its proliferation were confirmed. Conclusions Based on the successful establishment of cell culture of tree shrew primary renal cells, the infectivity to the obtained cells and proliferation of EV71 virus in the cells are confirmed. The model of EV71 virus-infected tree shrew primary renal cells is initially established.

Tree shrew, primary renal cells；EV71 virus；Virus proliferation；Protein VP1；Infection model

XIA Xue-shan, E-mail: oliverxia2000@aliyun.com; DAI Jie-jie, E-mail： djj@imbcams.com.cn

国家科技支撑计划项目子课题 (2014BAI01B01)。

杨铭 (1991-)，男，硕士生，研究方向：病毒树鼩模型。E-mail： qjyangming@163.com

夏雪山，教授，研究方向：分子病毒学。E-mail： oliverxia2000@aliyun.com； 代解杰，研究员，主要研究方向：树鼩动物模型。E-mail： djj@imbcams.com.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0117-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.002

2016-12-08