直肠癌组织中bcl-2及ck-20表达与临床病理因素的相关性

裴锐锋，徐 为，杨为彬

（江苏省徐州市肿瘤医院，江苏 徐州 221000）

直肠癌组织中bcl-2及ck-20表达与临床病理因素的相关性

裴锐锋，徐 为，杨为彬

（江苏省徐州市肿瘤医院，江苏 徐州 221000）

目的探讨直肠癌组织中bcl-2、ck-20的表达及与临床病理因素相关性关系，分析二者对直肠癌的发生、发展及远处转移的影响。方法用免疫组织化学S-P法，检测bcl-2及ck-20在直肠癌组织、癌旁组织中的表达情况，采用X列表进行x2检验及spearman等级相关分析bcl-2及ck-20的表达与患者年龄、性别、肿瘤侵及范围、肿瘤距肛门距离、病理分型、淋巴结转移、远处转移和临床分期等各因素之间的关系，数据统计用SPSS11.0统计软件完成。结果1.53例直肠癌组织中bcl-2阳性表达率54.53%，其中19例（+），10例（++）。11例癌旁组织中2例表达呈阳性，阳性率为18.18%，bcl-2在直肠癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织中的阳性表达率，其差异有统计学意义（x2=5.2281，P＜0.05）。结论1.直肠癌组织中bcl-2、ck-20表达较癌旁组织明显增强。2.直肠癌组织中bcl-2、ck-20的表达可作为判断直肠癌发展、转移和预后的重要指标。

直肠癌；bcl-2；ck-20；局部淋巴转移；远处转移

直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在欧美所有癌症致死患者中占8%-10%[1]，近年来也一直呈现上升趋势。我国直肠癌发病率在10-20/10万人次。在我国直肠癌患者中以低位直肠癌多见，男性多于女性，年龄多在40-60间。本研究中直肠癌组织中bcl-2、ck-20的表达是经免疫组化法检查得出，同时分析研究其临床和病理参数的关系。

1 材料与方法

1.1 标本收集

此次研究选取自1994～2003年期间徐州医学院附属医院病理科直肠癌外科的53例手术石蜡包埋标本，术前无任何治疗史，对照组为当中的11例癌组织远端的正常细胞组织，其中男性33名，女性20名，最大85岁，最小30岁，中位年龄58.7岁；其中高分化14例，中分化25例，低分化14例；其中腺癌48例，2例不典型增生伴癌变，两例腺癌伴部分粘液细胞癌，1例腺癌伴印戒细胞癌，临床分期分为，PTis原位癌，限制在上皮基底膜延至粘膜肌层，但粘膜肌层并未被穿破，T1侵入粘膜下层，T2穿入但未完全浸透肌层，T3可以浸透肠壁直至肠壁外软组织，却不能浸透浆膜表面及邻近组织，PT4 a侵润邻近器官或组织，T4b侵入壁腹膜伴或不伴邻近结构浸润，包括游离穿孔入腹腔者，N中的N0：部分淋巴结未转移；N1：部分淋巴结发生转移；M中的M0：远端淋巴结未发生转移；M1：远端淋巴结发生转移；其中Ⅰ期16例（分期见下图表1），Ⅱ期19例，Ⅲ期11例，Ⅳ期7例。见表1。

表1 TNM分期

1.2 试剂

兔抗人Bcl-2多克隆抗体、兔抗人ck-20多克隆抗体、免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉生物制剂有限公司。

1.3 试验使用的设备

日产奥林巴斯的显微镜；2）海尔微波炉；3）海尔冰箱；4）恒温箱设备；5）重庆试验仪器厂的蒸馏水制作设备。

1.4 方法

1.4.1 染色操作方法

根据设备上的操作说明进行试验。

（1）使用酒精等试剂对石蜡进行处理并取适量冲洗液进行处理随后进行切片操作。

（2）进行切片操作时，使用酶对石蜡进行处理，并对实验操作的环境进行温度控制，温度应在25摄氏度左右，等待十分钟进行孵育。

（3）取用适量的羊血清对做好的切片进行处理，并将样本放到温度在37摄氏度左右的环境中进行孵育，持续时间一刻钟左右，随后进行多次冲洗处理。

（4）取50微升的生物素试剂，并加入到做好的切片中，每份切片都需要进行标记，将处理好的样本放置到环境为37摄氏度的环境中进行孵育，持续时间为15～20分钟，随后进行多次冲洗处理。

（5）取50微升的酶溶液对做好的切片进行下一步处理，随后将样本放置到环境为37摄氏度的环境中进行孵育，持续时间为15～20分钟，随后进行多次冲洗处理。

（6）使用蒸馏水设备制作蒸馏水，在做好的切片上滴入显色液，等待样本充分反应之后使用制备的蒸馏水进行清洗。

（7）取适量苏木素对样本进行染色处理，等待三分钟后使用制备好的整理水进行清洗。

（8）进行对照分析：按照检验结果，切片检验反应为阳性，将PBS设置为研究中的空对照，所有染色环节都按照相应的标准进行分析。

1.4.2 评价标准分析

Bcl-2存在于癌细胞细胞核的周围，并且在细胞质中也有发现，检验为阳性的细胞在显微镜观察中呈现为黄色。如果观测到呈现为阳性的黄色细胞数量占总体的5%以内则为阴性，如果占总体的6%到30%则评定为弱阳性；如果阳性细胞数量超过30%，最多在60%内评定为中阳性；数量超过60%评定为强阳性。CK20定位于细胞质内，阳性细胞呈棕黄色，边缘处显著，阴性者无着色。根据阳性表达率分为：阴性，阳性细胞数＜20%；阳性，20%＜阳性细胞数＜60%；阳性细胞数＞60%为强阳性的检测结果[2]。

1.5 统计学分析

所有试验过程取得的数据都通过SPSS 20.0计算分析，通过x2对取得的数据进行分析检验，如果计算得到P＜0.05表示试验结果有统计差异，若计算得到P＞0.05则表示虽然存在差异但不显著。

2 结 果

2.1 直肠癌组织、癌旁正常组织中bcl-2、ck-20表达情况

bcl-2主要表达于核周级胞质，为棕黄色颗粒，见图片1、2。在53例直肠癌组织中，24例表达阴性，29例表达阳性，阳性率为54.72%，其中（+）19例，（++）3例，（+++）7例。癌旁正常组织中2例表达阳性，见图3，阳性率18.18%。

图1 直肠癌组织中bcl-2阳性表达 低倍10×10

图2 bcl-2主要表达于内质网 高倍10×40

图3 癌旁组织bcl-2弱阳性表达低倍10×10

bcl-2在直肠癌组织检测结果中的阳性率较高，超过癌旁的检测结果，二者存在统计差异，相关统计值计算结果为x2=5.2281，P＜0.05）。见表2。

表2 直肠癌组织、癌旁正常组织bcl-2、ck-20的表达 [n（%）]

ck-20阳性表达为胞质呈棕黄色颗粒，在53例直肠癌组织中23例阴性，30例表达阳性，阳性率为43.40%，其中（+）23例，（++）7例，癌旁正常组织中1例表达阳性，阳性率9.09%，ck-20在直肠癌组的检测水平大幅超过癌旁的检验结果，对比存在统计差异，相关统计数值x2=5.842，P=0.001。见表3。

表3 bcl-2、ck-20表达与局部淋巴转移、远处转移的关系 [n（%）]

2.2 各病理因素与bcl-2、ck-20表达的关系

本文结合bcl-2、ck-20表达分析其与临床分期、年龄、性别、病理分型、肿瘤部位、肿瘤范围、是否转移、手术方式、CEA、P53等的关系。实验按性别分成女组和男组，按年龄分为大于50岁组和小于50岁组；按照肿瘤距离肛门＜5cm分为一组，距离≥5cm为一组；病理分型分为高、中、低分化；淋巴转移分为有转移组和无转移组；肿瘤侵及范围分为侵及局限于粘膜层，侵及肌层及侵及浆膜层（全层）；有无远处转移分为有远处转移组和无远处转移组；p53分为表达阳性组和表达阴性组（p53分为阳性数＜5%为阴性，5%-40%为阳性，＞40%为强阳性）；CEA分为表达阳性组和表达阴性组（CEA＜5ng/ml为阴性，＞5ng/ ml为阳性）；手术方式分为Miles术式组，Dixon术式组和其它手术方式组；将其分为两组，Ⅰ期和Ⅱ期为一组，Ⅲ期和Ⅳ期为一组。

2.3 各病理因素与1bcl-2表达的关系

根据表2数据可知年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤范围、组织分型、淋巴局部转移、CEA等每个分组的bcl-2表达差异不明显P＞0.0，没有统计学意义，而不同TNM分期、P53和远处转移不同组间bcl-2表达有明显统计学差异（P＜0.05）。

2.3.1 bcl-2表达与TNM分期的关系

35例Ⅰ-Ⅱ期直肠癌组织中bcl-2阳性表达23例，阳性率65.71%；18例Ⅲ-Ⅳ期直肠癌组织中bcl2阳性表达6例，阳性率33.33%。Ⅲ-Ⅳ期组bcl-2阳性率明显高于Ⅰ-Ⅱ期组，有统计学意义（x2=8.7690，P＜0.05）。Spsearman等级相关分析得出bcl-2表达水平与TNM分期呈负相关（r=-4908，P＜0.05）。

2.3.2 bcl-2与p53表达的关系

9例p53表达阴性的直肠癌组织中bcl-2阳性表达9例，阳性率100%；44例p53表达阳性的直肠癌组织中bcl-2阳性表达20例，阳性率45.45%。不同水平的p53之间bcl-2表达差异有明面统计学意义（x2=14.5627，P＜0.05）。Spearman等级相关分析得出bcl-2表达与p53水平呈负相关（r=-0.6583，P＜0.05）。

2.3.3 bcl-2与远处转移的关系

46例远处无转移的直肠癌组织中bcl-2阳性表达为9例，阳性率63.04%，7例有远处转移的直肠癌组织中阳性表达0例，阳性率0%。两组间差异明显，有统计学意义（x2=9.7455，P＜0.05）。Spearman等级相关分析得出bcl-2表达与远处转移呈负相关（r=-0.4，P＜0.05）。

2.4 各病理因素与ck-20表达的关系

根据表2数据可知年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤范围、组织分型、淋巴局部转移、CEA等每个分组的ck-20表达差异不明显P＞0.0，没有统计学意义；而不同TNM分期、局部淋巴结转移、p53及远处转移不同组间ck-20表达有明显统计学差异（P＜0.05）。

2.4.1 ck-20与TNM分期的关系

35例Ⅰ-Ⅱ期直肠癌组织中ck-20阳性表达6例，阳性率17.17%，18例Ⅲ-Ⅳ期直肠癌组织中ck-20阳性表达17例，阳性率94.44%。两组间ck-20表达差异有统计学意义（x2=21.0913，P＜0.05）。Spsearman等级相关分析得出ck-20表达与TNM分期呈正相关（r=0.6307，P＜0.05）。

2.4.2 ck-20与局部淋巴结转移的关系

35例局部无淋巴转移的直肠癌组织中ck-20阳性表达7例，阳性率20%，18例有局部淋巴结转移的直肠癌组织中阳性表达16例，阳性率88.89%。两个组别ck-20的表达差异明显，P＜0.05，具备统计学意义。通过Spsearman等级分析可知淋巴局部结转移与ck-20正相关。

2.5 bcl-2与ck-20在直肠癌组织中的关系

53例直肠癌组织中ck-20表达阴性30例，其中bcl-2阳性表达16例，占53.33%，阴性14例，占46.67%；23例ck-20阳性表达组织中bcl-2阳性表达13例，阳性率56.52%，阴性10例，占43.48%。ck-20不同表达水平间bcl-2表达无明显统计学意义（x2=0.0535，P＞0.05），Spearman等级相关分析显示ck-20表达水平与bcl-2无相关。

3 讨 论

3.1 bcl-2在直肠癌组织中的表达及临床意义

目前，bcl-2被认为是抑制凋亡基因，其在18q21.3染色体定位，大概是230kb，在染色体外膜、内质网、核膜上由bcl-2蛋白定位。凋亡的过程是程序化的、多基因调控的，其中bcl-2是凋亡调控的中心环节。本研究采用免疫组化的方法检测了直肠癌组织、癌旁正常组织中bcl-2的表达情况。试验结果显示bcl-2在直肠癌组织中阳性率为54.72%，在癌旁组织中的阳性率为18.18%，癌旁组织的阳性表达率明显低于直肠癌组织，P＜0.05，差异显著。这与国内外报道bcl-2在结直肠癌组织中异常表达结论一致[3]。在病理和生理影响下，bcl-2和它的蛋白产物是调节凋亡的重要因素。如果bcl-2表达过度，则抑制凋亡现象[4]。所以，bcl-2可以延长细胞寿命，堆积细胞，发挥其始动作用。有研究表明bcl-2的表达会受到p53的直接影响，而bcl-2可以抑制p53使细胞凋亡，证明bcl-2和p53可以共同调节凋亡细胞[5]。而本次实验显示p53和bcl-2是负相关，相一致与以上研究。有研究表明直肠癌和bcl-2表达紧密相关，负相关于Dukes分期，直肠癌晚期可以显示出bcl-2表达有大量丢失现象[6-7]，此结论在本试验再次得到论证。

3.2 ck-20在直肠癌组织中的表达及临床意义

在1990年研究发现，ck-20包括48553个分子量、氨基酸有424个，ck-20为CK酸性、18 kb总长编码DNA、有5.66等电点、内含子有7个、外显子有8个。1.75 长kbmRNA。ck20合成后会第一个出现在肠粘膜上皮（第8周胚胎），它主要表达于胃肠道上皮、泌尿道上皮和默克尔细胞[9]，在正常外周血、骨髓和淋巴结检测不到ck-20[10]，作为观察大肠癌微转移的指标，具有一定的特异性[11]，已得到认可[12]。在本试验中ck-20在直肠癌组织中阳性表达率为43.40%，在癌旁组织中阳性表达率为9.09%，二者存在显著性差异（P＜0.05）。与其他角蛋白不同的是，ck-20具有局限性，它只定位在胃肠道上皮细胞，所有大肠癌会侵袭、扩散、转移到别的组织保持稳定。在对转移的直肠癌检测中ck-20是良好的标志物[13]。国外研究表明，ck-20在正常组织不表达或极低表达[14]，本试验结果与上述结论一致。在直肠癌分期方面，本试验结果Ⅲ-Ⅳ期ck-20阳性表达明显高于Ⅰ-Ⅱ期（P＜0.05），与孙念绪等[15]研究结论一致。

4 结 论

直肠癌组织中bcl-2、ck-20表达较癌旁正常组织明显增强。直肠癌组织中bcl-2表达与TNM分期、P53和远处转移相关，呈负相关；ck-20表达与TNM分期、局部淋巴结转移、p53及远处转移相关，呈正相关。

直肠癌组织中bcl-2、ck-20表达可以作为判断直肠癌发展、转移和预后的重要指标。

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本文编辑：吴玲丽

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ISSN.2095-8242.2017.010.1861.04