Tris-Hcl提取法提取鹿茸蛋白质工艺的研究

蔡文君，赵文海*，杨春辉

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

Tris-Hcl提取法提取鹿茸蛋白质工艺的研究

蔡文君，赵文海*，杨春辉

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

目的本试验以鹿科动物梅花鹿（Cervus Nippon Temminck）的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角为试验材料，优选Tris-HCl提取法的最佳工艺，并考察其对鲜鹿茸与干鹿茸对提取率的影响。方法采用正交试验法，以鹿茸蛋白含量为评价指标，考察温度，时间，物液比，pH值等对提取工艺的影响；采用所得的最优条件，对同等质量的干茸及鲜茸的提取率进行比较。结果Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白的最优条件为缓冲液pH值为8，提取时间为10 min，料液比为1:12，提取温度为20℃；鲜茸作为提取基质效果明显优于使用干茸提取鹿茸蛋白质。结论本研究第一次使用Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白质，丰富了鹿茸蛋白的提取方法，通过对比鲜鹿茸与干鹿茸的提取效果，更加明确了选材基准，为后续的研究，打下坚实的基础。

鲜鹿茸、鹿茸蛋白、Tris-HCl提取法、正交试验

鹿茸首载于《神农本草经》，列为中品。《本草纲目》记载“鹿茸，生精补髓，养血益阴，强筋健骨”。具有壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒的功效，用于治疗阳痿滑精、宫冷不孕、畏寒、眩晕、耳鸣腰脊冷痛、漏带下等症[1]。

现代药理学研究表明，鹿茸的组成成分复杂，最新发现的肽类物质为鹿茸活性成分之一。鹿茸多肽由促进细胞有丝分裂活性剂促进细胞分裂的作用，可促进

伤口愈合，提高免疫力，抗氧化、抗炎等多方面的药理活性。作为生长因子类药物，具有促进神经再生，加快神经轴突生长速度，有助功能恢复，加速创伤愈合功能[2]。鹿茸多肽提取时缓冲液多为酸性或中性盐，且缓冲液pH值不同，提取率也不同[3-6]。Tris-HCl提取蛋白法为首次用于鲜茸蛋白的提取，本实验采用Tris-HCl提取的方法，对梅花鹿鹿茸中的蛋白质进行提取分离，并采用正交试验设计考察不同提取温度，提取时间，物液比，及Tris-HCl法的pH值等，以期优选出Tris-HCl法提取梅花鹿茸蛋白质的最佳提取工艺。

1.Tris-HCl法提取梅花鹿鲜鹿茸蛋白质

1 材料与方法

1.1.1 仪器

Sigma台式高速冷冻离心机3k15，imark酶标仪、FDU-1200冷冻干燥机、手持式匀浆机，十万分之一分析天平。

1.1.2 试剂与材料

牛血清蛋白（购于中国药品生物制品检定所）、Folin酚试剂、Lowry试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）、Tris-Hcl缓冲溶液（自制）。

1.1.3 鹿茸蛋白质的提取

将梅花鹿二杠鹿茸鲜品使用切片机切成薄片，剔除边缘绒毛，用预冷的蒸馏水反复冲洗至无血色后称重，手持式匀浆机12000r/min反复匀浆，匀浆过程中不断添加匀浆液（Tris-Hcl缓冲溶液，p H8.0）；离心（12000r/min，30 min，4℃），取上清液。除盐后冻干，得到鹿茸蛋白质粗提物，-20℃保存。

1.1.4 鹿茸多肽含量的测定

1.1.4.1试剂准备 将 5mg/mL的BSA标准蛋白用蒸馏水稀释为0.1 mg/mL；样品用蒸馏水做适当稀释为1 mg/mL，0.1 mg/mL两个稀释度；根据标准品和样品计算所需的工作液，溶液A：B为1：50，充分混匀。

1.1.4.2标准曲线的建立

1）准备22个微量离心管，设置重复管号0-10，按表一配置BSA浓度梯度的标准溶液；

2）各离心管加入1 L的反应工作液，混匀，室温下静置10 min；

3）各离心管加入10ul的Folin酚试剂，迅速混匀，室温下静置30 min；

4）酶标仪上测量各离心管中的A750值，以标准品不同梯度的BSA测定的A750值为纵坐标，对应蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2 Tris-HCl法提取工艺正交试验设计

查阅参考文献[7-9]，通过预实验筛选的结果，选取Tris-HCl缓冲液pH值（A），提取时间（B），料液比（C），提取温度（D）这4个因素，每个因素设3个水平，试验因素水平分配见表1。

表1 正交试验因素水平表（n，%）

结果表明，影响多肽提取率的因素按其影响程度的大小分别为缓冲液pH值（A）＞提取时间（B）＞料液比（C）＞提取温度（D）；缓冲液pH值对鹿茸蛋白提取率有显著性差异，因为蛋白质带电荷，当缓冲液pH值发生改变时，有的蛋白质会发生等电点而沉淀，导致多肽含量降低，因此选择缓冲液pH8为最佳浓度。而料液比对多肽的提取影响较小，因为当料液比为1：8时，Tris-Hcl缓冲液中的蛋白质含量基本达到饱和，料液比再增加也不会提高多肽的提取率。而提取温度对蛋白质提取的影响最小。所以，正交试验的最优条件为A3B1C3D2，由结果可知即缓冲液pH值为8，提取时间为10 min，料液比为1:12，提取温度为20℃最优。

2 鲜鹿茸与干鹿茸提取率对比

2.1 方法

选取相同质量的鲜鹿茸与干鹿茸各100 g，使用选取的最优Tris-HCl提取法提取梅花鹿鹿茸蛋白，即以缓冲液pH值为8，提取时间为10 min，料液比为1:12，提取温度为20℃的最优提取条件为基准，分别进行匀浆-离心-透析-冻干，然后通过Lowry试剂盒对蛋白含量进行测定。

2.2 结果

在相同的提取条件下，测得鲜鹿茸的蛋白含量为23.54%，干鹿茸中的蛋白质含量为17.31%。由此可见，提取鹿茸蛋白质时以鲜茸作为提取基质效果明显优于使用干茸提取鹿茸蛋白质。

3 结 论

Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白质的条件以缓冲液pH值为8，提取时间为10 min，料液比为1:12，提取温度为20℃最优。

提取鹿茸蛋白质时以鲜茸作为提取基质效果明显优于使用干茸提取鹿茸蛋白质。

近年来，鹿茸中蛋白质的研究以呈现出白热化的趋势，而蛋白质的提取是所有研究中的基础与前提，本研究第一次使用Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白质，丰富了鹿茸蛋白的提取方法，通过对比鲜鹿茸与干鹿茸的提取效果，更加明确了选材基准，为后续的研究，打下坚实的基础。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2015:323-324.

[2] 陶荣珊,胡太超,李金伟,等.鹿茸多肽提取分离纯化及药理作用研究进展[J].经济动物学报,2014,18(4):238-242.

[3] 严铭铭,曲晓波,钟英杰,等.梅花鹿鹿茸中促进海马神经细胞增殖蛋白的分离纯化[J].中草药,2007,38(8):1163-1167.

[4] 李银清.梅花鹿茸胶原的分离提取及活性研究[D].长春:长春中医药大学,2007.

[5] 王 丰,梅子青,周秋丽,等.鹿茸多肽的分离纯化及药理活性[J].吉林大学学报:理学版,2003,41(1):111-114.

[6] 刘瑞江,张业旺,闻崇炜,等.正交试验设计和分析方法研究[J].实验技术与管理,2010,27(9):52-55.

[7] 刘明磊.正交试验设计中的方差分析[D].东北林业大学,2011.

[8] 盛永莉.正交试验设计及其应用[J].济南大学学报(综合版),1997(3):69-73.

[9] 段海生.Tris-Hcl法提取蝶类干标本蛋白质的研究[J].江大大学学报:自然科学版,2010,38(2):64-67.

本文编辑：王雨辰

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ISSN.2095-8242.2017.010.1959.02

赵文海，E-mail：6177252@163.com