晚期糖基化终末产物在多囊卵巢综合征大鼠模型中的表达

赵彦楠，刘洪祥，霍佳宁，马晓欣

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

晚期糖基化终末产物在多囊卵巢综合征大鼠模型中的表达

赵彦楠，刘洪祥，霍佳宁，马晓欣

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

目的研究晚期糖基化终末产物（AGEs）在脱氢表雄酮（DHEA）诱导的多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠模型中的表达。方法采用DHEA造模法建立PCOS大鼠模型。造模成功后，选用竞争性ELISA法检测血清AGEs表达水平，免疫组织化学法检测大鼠模型卵巢组织中AGEs的表达。结果实验组大鼠血清AGEs水平明显高于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，AGEs在实验组卵巢组织中呈高表达（P＜0.01）。结论AGEs在PCOS大鼠模型中高表达，在PCOS诊断和发病机制的研究中均具有重要的参考价值。

多囊卵巢综合征；晚期糖基化终产物；大鼠

多囊卵巢综合征（polycystic covarian syndrome，PCOS）是育龄期妇女常见的内分泌紊乱疾病，以持续性无排卵、高雄激素血症、卵巢多囊样改变为特征的综合症候群。胰岛素抵抗、糖代谢异常是PCOS的核心病理机制［1］，两者也同样存在于其远期并发症（2型糖尿病、心血管疾病）［2］。有研究［3］表明，糖尿病患者血清中晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）含量要远远高于正常人，并且在高血糖的形成中起到了重要的作用。AGEs是在持续高糖状态下，还原糖的游离醛基，在非酶促条件下与蛋白质、脂质、核酸等物质的自由氨基经过脱水、缩合、裂解、环化、氧化修饰后形成的稳定的终末产物。AGEs与其受体晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）相互作用能够促进系统炎症反应的发生，造成细胞毒性和细胞损伤，进而引起一系列疾病［4-5］。研究［6］表明，AGEs与一些代谢性疾病的发生发展密切相关。PCOS是一种代谢障碍性全身性疾病［7］，目前AGEs对它的影响还知之甚少。本课题组前期研究［8］发现，脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）联合高脂饮食法制作PCOS大鼠模型出现的卵巢病理改变及激素水平改变等典型内分泌变化与PCOS患者相似，是一种较为理想的PCOS动物模型。本研究通过建立PCOS大鼠模型，检测AGEs在PCOS大鼠模型中的表达，并探讨其对PCOS的临床意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

选取40只21日龄雌性Sprague-Dawly（SD）大鼠，体质量200～250 g，均购自中国医科大学本溪实验动物中心。AGE-ELISA试剂盒购自美国Cloud-Clonecorp公司。兔多克隆抗体AGE购自美国Abcam公司。免疫组化SP试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCOS模型建立：采用随机数字表法将40只大鼠随机分为实验组（n=20）和对照组（n=20）。每只大鼠均饲以高脂颗粒饲料，自由饮水，室温（22.0±3.0）℃，照明采用昼夜亮暗周期循环。将DHEA（60 mg/kg）溶于0.2 mL注射油剂中，实验组大鼠每日颈背部皮下注射DHEA+注射油剂0.2 mL，连续20 d；对照组大鼠每日颈背部皮下注射0.2 mL注射油剂，连续20 d。

1.2.2 标本采集：造模成功后行腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血（约5 mL），分离血清，-80°C冻存备用。分离摘取双侧卵巢，经修剪多余组织及脂肪组织后，双侧卵巢置于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片待测。

1.2.3 血清中AGEs测定：ELISA法检测血清中AGEs水平。操作步骤按说明书进行，450 nm波长酶标仪进行检测。

1.2.4 免疫组织化学染色检测：采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin peroxidase，SP）法进行AGEs免疫组化染色，一抗浓度稀释为1∶100，以PBS代替一抗作为阴性对照。阳性结果判断，光学显微镜下观察为棕黄色颗粒即AGEs表达阳性。高倍镜下每例随机选取5个不重叠的视野，估计阳性细胞百分数后取均值。按阳性细胞百分数评分，＜5%为0分，5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分；按染色强度评分：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；两项相乘后取平均值，0～4分为阴性表达，＞4分为阳性表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.12 组大鼠卵巢形态学比较

光学显微镜下卵巢HE染色可见对照组卵巢形态正常，卵泡发育正常，皮质可见不同发育阶段的卵泡及黄体。实验组镜下可见较多闭锁卵泡及囊性扩张性卵泡且多集中在卵巢边缘，卵泡内颗粒细胞层数明显减少甚至消失，卵巢呈典型的多囊样变。符合多囊卵巢病理改变。见图1。

图12 组大鼠卵巢组织HE染色切片×4Fig.1HE staining of ovariany tissue in the control group and experimental groups×4

2.22 组血清中AGEs水平比较

结果显示，实验组血清中AGEs含量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.3 AGEs在PCOS大鼠模型卵巢中的表达

免疫组化结果显示，对照组卵巢颗粒细胞及卵泡膜细胞染色强度减弱，甚至未见染色（图2A）。在实验组中卵巢颗粒细胞的胞质及部分卵泡膜细胞可见棕褐色颗粒，呈明显的阳性表达，阳性表达率为70%（图2B）。半定量分析结果显示，与对照组相比，AGEs在实验组卵巢组织中呈高表达，差异有统计学意义（χ2=10.101，P＜0.01），见表1。

表1 对照组及实验组血清及卵巢中AGEs表达Tab.1Expression of AGEs in the ovarian tissues of the control and experimental groups

3 讨论

近年来的研究［9］发现，AGEs在多种代谢性疾病（如肥胖、糖尿病等）中起重要作用。AGEs通过与其受体RAGE结合激活多种下游信号通路，如细胞核因子κB（nuclear factor kappa B，NK-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等，进而导致细胞氧化应激及促进炎症反应的发生［10-11］。AGEs引起氧化应激的形成，进一步的氧化应激刺激更多的AGEs合成，致使机体长时间处于一种慢性低度炎症状态［12-13］。多位国内外研究学者［14］证实，PCOS患者体内C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）等多种炎性细胞因子水平升高，进而引发多种病理状态，还可能与胰岛素抵抗及高雄激素血症有关。本研究发现，实验组AGEs浓度明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示AGEs可能与PCOS的发生密切相关，这为PCOS的诊断以及发病机制研究提供了一定的理论基础。

在人卵巢颗粒细胞系模型中，AGEs通过干扰颗粒细胞中促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）行为激活细胞外信号调节激酶（external signal regulated kinases/mitogen activated protein kinase，ERK1/ 2MAPKs）通路从而引起异常卵泡发育，导致卵巢功能障碍［15］。在卵泡发育过程中，卵母细胞由于自身难以合成葡萄糖，能量大部分来源于颗粒细胞糖酵解［16］。AGEs可能通过减少颗粒细胞膜表面葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLU-4）受体数量降低葡萄糖摄入从而影响卵母细胞生长［17］。另外，TATONE等［18］研究发现，卵母细胞内累积的AGEs还能够干扰细胞内线粒体功能、诱导细胞凋亡以及造成DNA损伤。本实验利用免疫组化的方法检测AGEs在实验组卵巢组织与对照组卵巢组织中的蛋白表达，证实AGEs在实验组卵巢中的表达远远高于对照组。并且，AGEs大量分布在卵巢颗粒细胞中，推测AGEs在颗粒细胞中表达增高可能是影响卵母细胞成熟发育，进而形成大量闭锁卵泡的重要因素。

综上所述，AGEs在PCOS大鼠模型血清及卵巢中表达均升高，并且在卵巢颗粒细胞中呈高表达。但AGEs在PCOS中的表达调控机制尚不完全清楚，有待深入研究。

参考文献：

［1］NI RM，MO Y，CHEN X，et al.Low prevalence of the metabolic syndrome but high occurrence of various metabolic disordersin Chinese women with polycystic ovary syndrome［J］.Eur J Endocrinol，2009，161（3）：411-418.DOI：10.1530/EJE-09-0298.

［2］JAYASENA CN，FRANKS S.The management of patients with polycystic ovary syndrome［J］.Nat Rev Endocrinol，2014，10（10）：624-636.DOI：10.1038/nrendo.2014.102.

［3］ISHIGURO H，NAKAIGAWA N，MIYOSHI Y，et al.Receptor for advanced glycationendproducts（RAGE）and its ligand，amphoterinare overexpressed and associated with prostate cancer development［J］.Prostate，2005，64（1）：92-100.DOI：10.1530/EJE-09-0298.

［4］KALEA AZ，SCHMIDT AM，HUDSON BI.RAGE：anovel biological and genetic marker for vascular disease［J］.Clin Sci，2009，116（8）：621-637.DOI：10.1042/CS20080494.

［5］WAUTIER MP，CHAPPEY O，CORDA S，et al.Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stresstoaltered gene expression via RAGE［J］.Am J Pathol，2001，280（5）：E685-E694.

［6］DIAMANTI-KANDARAKIS E，PIPERI C，PATSOURIS E.Immunohistochemical localization of advanced glycation end-products（AGEs）and their receptor（RAGE）in polycystic and normal ovaries［J］.Histochem Cell Biol，2007，127（6）：581-589.DOI：10.1007/ s00418-006-0265-3.

［7］徐良智，单丹.多囊卵巢综合征——一种代谢障碍性全身疾病在卵巢的表现［J］.中华妇幼临床学杂志，2011，7（5）：407-411. DOI：10.3877//cma.j.issn.1673-5250.011.05.001.

［8］MANNERÅS L，CAJANDER S，HOLMÄNG A，et al.A new rat model exhibiting both ovarian and metabolic characteristics of polycystic ovary syndrome［J］.Endocrinology，2007，148（8）：3781-3791. DOI：10.1210/en.2007-0168.

［9］REPACI A，GAMBINERI A，PASQUALI R.The role of low-grade inflammation in the polycystic ovary syndrome［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，335（1）：30-41.DOI：10.1016/j.mce.2010.08.002.

［10］YAMAGISHI S，MATSUI T.Advanced glycationendproducts，oxidative stress and diabetic nephropathy［J］.Oxid Med Cell Longev，2010，3（2）：101-108.DOI：10.4161/oxim.3.2.11148.

［11］SIMS GP，ROWE DC，RIETDIJK ST，et al.HMGB1 and RAGE in inflammation and cance［J］.Annu Rev Immunol，2010，28（28）：367-388.DOI：10.1146/annurev.immunol.021908.132603.

［12］LI Q，DU J，FENG R，et al.A possible new mechanism in the pathophysiology of polycystic ovary syndrome（PCOS）：the discovery that leukocyte telomere length is strongly associated with PCOS［J］.J Clin Endocrinol Metab，2014，99（2）：234-240.DOI：10.1210/jc.2013-3685.

［13］LEE H，OH JY，SUNG YA，et al.Is insulin resistance an intrinsic defectin asian polycystic ovary syndrome?［J］.Yonsei Med J，2013，54（3）：609-614.DOI：10.3349/ymj.2013.54.3.609.

［14］GONZÁLEZ F.Inflammation in polycystic ovary syndrome：under pinning of insulin resistance and ovarian dysfunction［J］.Steroids，2012，77（4）：300-305.DOI：10.1016/j.steroids.2011.12.003.

［15］DIAMANTI-KANDARAKIS E，PIPERI C，LIVADAS S，et al.Interference of AGE-RAGE signaling with steroidogenic enzyme actionin human ovarian cells［M］.San Francisco：Endocrine Society，2013.

［16］SUTTON-MCDOWALL ML，GILCHRIST RB，THOMPSON JG. The pivotal role of glucose metabolism in determining oocyte developmental competence［J］.Reproduction，2010，139（4）：685-695.DOI：10.1530/REP-09-0345.

［17］PIPERI C PE，KOUTSILIERIS M，DIAMANTI-KANDARAKIS E. Advanced glycation end-products inhibit insulin signaling in human granulosa cells：a causative link to PCOS pathogenesis［M］. San Francisco，CA：Endocrine Society，2013.

［18］TATONE C，HEIZENRIEDER T，DIEMIDIO G，et al.Evidence that carbonyl stress by methylglyoxal exposure induces DNA damage and spindle aberrations，affects mitochondrial integrity in mammalian oocytes and contributes to oocyte ageing［J］.Hum Reprod，2011，26（1）：1843-1859.DOI：10.1093/humrep/der140.

（编辑 武玉欣）

Expression of Advanced Glycation End Products in a Rat Model of Polycystic Ovarian Syndrome

ZHAO Yannan，LIU Hongxiang，HUO Jianing，MA Xiaoxin
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression of advanced glycation end products（AGEs）in a rat model of polycystic ovarian syndrome（PCOS）induced by dehydroepiandrosterone.MethodsThe PCOS rat model was established using dehydroepiandrosterone.After confirming that the model rats were set up successfully，serum AGEs concentrations were measured using competitive ELISA and the expression of AGEs in the ovarian tissues of these rats was detected using immunohistochemistry.ResultsThe serum AGEs level in the experimental group were significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.Furthermore，AGEs expression were significantly higher in the experimental group than in the control group（P＜0.01）.ConclusionAGEs are highly expressed in the rat PCOS model，signifying their importance in the diagnosis and pathogenesis of PCOS.

polycystic ovarian syndrome；advanced glycation end products；rat

R711.75

A

0258-4646（2017）05-0388-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.002

国家自然科学基金（81472438，81272874）；辽宁省科学技术计划（2013225079）；沈阳市科学技术项目（F14-158-9-47）

赵彦楠，（1993-），女，硕士研究生.

马晓欣，E-mail：maxiaoxin666@aliyun.com

2017-01-13

网络出版时间：