响应面法优化酶辅助提取废弃烟叶中烟碱

吴映捷,吕新美,闫兵兵,胡 鲲,杨先乐

上海海洋大学 水产与生命学院,国家水生动物病原库,上海 201306

响应面法优化酶辅助提取废弃烟叶中烟碱

吴映捷,吕新美,闫兵兵,胡 鲲,杨先乐*

上海海洋大学 水产与生命学院,国家水生动物病原库,上海 201306

为了从废弃烟叶高效提取烟碱，本文利用响应面法对在废弃烟叶中烟碱的提取条件进行优化。以烟碱的得率为评价指标，设计酶解时间、酶解温度，pH值及提取时间4因素3水平的实验模型，采用Design Expert 8.0.6分析软件对烟碱的提取条件进行优化研究。优选出最佳提取工艺为：酶解时间2.0 h，酶解温度48.50℃，酶用量2.10%，pH4.00。测定烟碱的得率为3.320%，与预测值3.32836%偏差较小，为废弃烟叶的烟碱提取提供理论依据。

烟碱;废弃烟叶;响应面法

烟草(Nicotiana tabacum L)是最广泛种植的经济作物之一。我国有世界最大的烟草生产和消费国量，烟草年产量占到世界总产量的40%左右，烟碱（Nicotine，Nic）是烟草中最主要的生物碱[1]。临床医学上有重要使用价值，严家川的研究发现其可以激活α7烟碱型胆碱能受体及减少促炎症细胞因子合成及释放，减轻炎症反应，改善疾病预后。给Alzheimer's症患者使用烟碱透皮贴剂可以使患者认知功能得到改善[2]。凌丽研究表明烟碱具有强抗炎作用，可以不依赖迷走神经完整性独立发挥作用[3]。张敏恒等经过研究表明烟碱也是农用杀虫剂的重要成分，对昆虫具有拒食、忌避、细胞凋亡和生殖毒性等作用可用于鱼类寄生虫防治，还能改善水质，清塘、疗效彻底的特点，无耐药性且残留低，且原料广，成本低，使用方便[4]。

现有的烟碱提取方法有溶剂萃取法[5]、蒸馏法[6]、离子交换法及超临界CO2提取法等[7-9]。对于生物碱类化合物，一般根据极性和水溶性选择提取方法，烟碱可溶于水，一般选择水作为提取溶剂。陈小东等采用单宁酸作沉淀剂，超声提取法来提取废次烟叶中烟碱。用水做为提取溶剂，用单宁酸来行沉淀反应，烟碱的提取率达1.06%[10]。曾淼洋等用减压内部沸腾法提取，实验乙醇浓度为70%，提取温度为50℃及操作压强为0.019 MPa时，内部沸腾过程4 min完成，烟碱提取率1.15%[11]。黄飞也以微波辅助的方法提取烟碱，观察了浸泡时间、微波功率、固液比、微波时间等条件对烟碱提取率的影响。微波辅助提取法提取烟碱最佳条件是：功率为800 W，辐射时间是7 min，浸泡时间为4 h，固液比1:7，该优化条件下，烟碱提取率能达到98.68%[12]。陈丽金用微波辅助的方法提取烟碱，发现微波对烟碱的提取有促进的作用。微波辅助提取的最佳工艺条件是微波功率为300 W，波时间为1 min，液固比为25:1，此工艺比未经微波处理的提法的提取率增加约11倍[13]。现在用于工业生产的主要为溶剂萃取法和蒸馏法，但是这些方法效率低下，而离子交换法和超临界CO2提取法虽然得率较高但是成本又难以控制，现有技术在提取效率和生产成本上难以达到平衡。酶解辅助提取法是指在传统溶剂法的基础上，利用生物酶降解细胞间质中的成分，破坏植物细胞壁结构，通过降低细胞的渗透阻力促进有效成分的溶出[14]。具有工艺简单、得率高的优点，可以用于工业大量生产。依据单因素提取实验结果，选取对提取有影响的酶解温度、酶解时间、酶用量和pH值四个因素，以烟碱得率为指标，采用中心组合设计－响应面法确定最佳提取工艺，并且具有试验次数少、精度高的优点，以期为废弃烟叶提取工业化提取提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

废弃烟叶由江西省赣州市渔业局提供，去掉老化病变部分，洗净，烘干，粉碎，过筛备用。实验中所用试剂均为分析纯。烟碱标准品购于美国Sigma公司（纯度≧98%），纤维素酶，诺维信公司，酶活力为20000 U/g。

HH-4S数显恒温水浴锅(上海贝凯生物化工设备有限公司)；UV751型紫外－可见光分光光度计（瑞利仪器分析有限公司产品）、AB104-S电子分析天平

1.2 实验方法

1.2.1 烟碱含量的测定 将烟碱标准液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL注入60 mL分液漏斗中，加柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液2 mL于分液漏斗、再加入2 mL甲基橙溶液，将分液漏斗中的溶液混合均匀，加入三氯甲烷5 mL，萃取时间2 min，静置分层，取三氯甲烷的分层加入比色皿中，测波长在420 nm处吸光度。烟碱溶液吸光度作纵坐标，烟碱量为横坐标绘标准曲线。烟叶中总烟碱含量按照《YC/T160-2002烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》测其中总烟碱含量[15]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 最佳酶解时间的筛选 称取过筛后的烟叶10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，选择了酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h作为考察因素，固定酶解温度选定为50℃，酶用量1.5%，pH值5，所得提取液过滤，放冷，得供试品溶液，测定，计算烟碱提取量；

1.2.2.2 最佳酶解温度的筛选 称取过筛后的烟叶10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，选择了酶解温度40、45、50、55、60、65℃作为考察因素，固定酶解时间1.0 h，酶用量1.5%，pH值5，所得提取液过滤，放冷，得供试品溶液，测定，计算烟碱提取量；

1.2.2.3 最佳酶用量的筛选 称取过筛后的烟叶10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，选择了酶用量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%作为考察因素，固定酶解时间1.0 h，酶解温度50℃，pH值5，所得提取液过滤，放冷，得供试品溶液，测定，计算烟碱提取量；

1.2.2.4 最佳pH值的筛选 称取过筛后的烟叶10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，选择了pH值3.5、4、4.5、5、5.5、6作为考察因素。固定酶解时间1.0 h，酶解温度50℃，酶用量1.5%，所得提取液过滤，放冷，得供试品溶液，测定，计算烟碱提取量。

1.2.2.5 烟碱含量的测定

烟碱的得率（mg/g）=C×V×n/m

C为根据烟碱标准曲线公式计算出的所测样品中烟碱浓度（mg/mL），V为提取液定容体积（mL），n为稀释倍数，m为烟叶的质量（g）。

2 响应面实验设计

2.1 标准曲线分析

以吸光度为纵坐标，烟碱提取量为横坐标作图，作出回归方程y=0.117x-0.031，R2=0.9927。

2.2 烟碱提取单因素实验

2.2.1 酶解时间对烟碱得率的影响

图1 烟碱提取量的标准曲线Fig.1 Standard curve of Nicotine amount

图2 酶解时间对提取效果的影响Fig.2 Effect of enzyme time on yield of Nicotine

由图2可知，烟碱的得率随酶解时间的增加而升高，酶解时间2 h后，随着酶解时间的延长，烟碱得率增势趋于平缓。原因为随着时间增长，酶活力可以得到充分发挥，酶解反应进行得较完全，提取液中烟碱含量便不再明显增加。

2.2.2 酶解温度对烟碱得率的影响

烟碱的提取率随酶解温度升高而增加，当温度为50℃时，到达峰值，酶解温度继续升高，烟碱的提取率开始减少。随着温度的升高，底物分子的热能增加，酶解反应的速率增加，提取率增大，但当温度继续升高，导致酶活性降低，酶解反应受抑制，因此温度升高得率降低。

2.2.3 酶用量对烟碱得率的影响

图3 酶解温度对提取效果的影响Fig.3 Effect of enzyme temperature on yield of Nicotine

图4 酶用量对提取效果的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on yield of Nicotine

烟碱的提取率随酶用量的增加不断升高，当酶用量到2%时，酶量再增加，烟碱的提取率没有明显变化。这可能是由于当酶用量低于最佳值时，酶解进行得不完全，烟碱释放出的量较少，提取率低，当达到最佳值时，酶解反应则较彻底，此时如再继续增加酶用量，酶解反应进行的程度没有太大的变化。

2.2.4 pH值对烟碱得率的影响

图5 pH值对提取效果的影响Fig.5 Effect of pH on yield of Nicotine

试验结果表明，烟碱得率随着酶解pH值的增大先增大后减小。原因可能是纤维素酶受到pH值的影响较大。

2.3 响应面优化实验分析

2.3.1 响应面实验因素水平的选择 在单因素实验的基础上对A（酶解时间）、B（酶解温度）、C（酶用量）和D（pH值）为考察因素，进行响应面试验，使用Design-expert 8.0.6 trial软件，以烟碱含量为指标，设计4因素3水平（共29个试验点、5个中心点）的响应面试验，每组试验重复3次，取其平均值，其因素水平如表1所示。

表1 Response surface试验因素与水平Table 1 Factors and levels in Response surface test

2.3.2 建立模型方程与显著性检验 对结果进行多元化回归拟合分析得到4个因素与烟碱得率之间二次回归模拟方程

得率=3.24+0.050A-0.38B-0.025C-0.075D-0.021AB+0.028AC+0.038A D+0.012BC+0.16BD-0.13C D-0.021A2-0.67B2-0.044C2-0.42D2

二次回归模拟方程其中一次项和二次项都有显著性影响因素，所以实验各因子对响应值的影响并不是线性关系。

表2 Response surface中心组合方案及响应值Table 2 Response surface central combination project and response values

该回归模型检验极为显著，P＜0.0001。失拟项P=0.2661，说明方程的拟合性较好。R2=0.9921说明模型相关度好。校正决定系数R2adg=0.9599说明模型能较好地反映酶解时间，酶解温度，酶用量，pH与烟碱得率之间的关系。变异系数CV值表达的是每个平均值偏离的状况，本实验CV=0.025%＜0.1%，说明实验的重复性好。从F值的分析结果可以看出，在所选的各因素水平范围内，对烟碱得率的影响大小的顺序为:酶解温度（F=531.13）、酶解时间(F=9.29)、酶用量(F=2.38)，pH值(F=0.011)。根据表3中P值可知，一次项A、B对烟碱得率的影响极显著，交互项中AB对烟碱得率的影响极显著，BD、CD对烟碱得率的有显著影响，AC对烟碱得率的影响显著，二次项B2、D2对烟碱得率有极显著影响,。响应面方程极显著地表示了Y与A、B、C、D的关系[16]

响应面是响应值对试验因子所构成三维空间曲面图，从响应面分析图上能清楚看出最佳条件及各参数之间的交互作用。两因素交互作用对烟碱得率影响的响应曲面见图6。A图为等高线，B图为其相对应的响应曲面图。利用三维图(图6)综合反映了各变量之间的交互关系，响应曲面图形越陡峭，即其交互作用越显著，图形平稳则说明交互作用比较微弱。图6可知，酶用量和酶解时间交互作用最强，酶解温度和pH交互作用最弱。酶解时间和酶解温度对得率的影响最为显著，在酶解时间1.5 h，酶用量2%时，当酶解时间一定时，烟碱得率随温度得增加先升高后降低，当酶解温度一定时，得率随温度的增加先快速升高再趋于平稳。

2.4 最佳工艺条件的确定及验证

图6 各两因素交互作用对烟碱影响Fig.6 The interactive effects of two factors on yield of Nicotine

3 讨论与小结

本实验采用纤维素酶法从废弃烟叶中提取烟碱，分解纤维素时能起到生物催化作用，能降低反应的活化能，使分解作用完全高效地进行。所以本实验采用纤维素酶催化提取得到烟碱提取得率高，实际应用时操作简单、反应得到产物的活性成分保存好、反应安全无毒，不会有溶剂残留的问题[17]。通过单因素实验分析和响应面法可于较准确地得出了最佳提取工艺，数据较为可靠，有良好的重复性[18]。在单因素试验的基础上，通过响应曲面分析对烟碱的提取工艺进行优化，并得到回归方程。试验首先考察了酶解时间、酶解温度 酶用量、pH等4组单因素水平对烟碱的影响，进行了响应面试验设计，结果表明，各影响因素对烟碱得率的影响程度大小依次为酶解温度、酶解时间、酶用量、pH。三维(3d)响应面回归方程的一个重要组成部分,可以直观地阐述了两个变量之间的交互作用,并确定最优水平,酶解温度和pH交互作用最强，酶解时间和酶用量的交互作用最弱，确定其最佳提取工艺条件并结合实际确定为得出影响烟碱的最佳提取工艺条件为：酶解时间2.00 h，酶解温度48.50℃，酶用量2.10%，pH值为4。根据优化条件进行三组平行实验，取平均值为3.320 mg/g，与预测值相差较小。得到回归方程与实际的情况拟合较好，进一步验证了该模型的可行性。实验结果说明该回归方程可以较好预测实验结果。因此，选择响应曲面法来优化烟碱的提取工艺是可行的[18-20]。

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Optimization of Nicotine Extracted from Abandoned Tobacco with Response Surface Method

WU Ying-jie,LV Xin-mei,YAN Bing-bing,HU Kun,YANG Xian-le*
College of Fisheries and Life Science/Shanghai Ocean University,NationalAquaticAnimal Pathogens,Shanghai 201306,China

To optimize the conditions for purification of Nicotine in abandoned Tobacco.Response surface method was used to design the test models with four factors including enzyme time,enzyme temperature,enzyme dosage,ultrasonic time at three levels based on the single factor experiment and the yield of Nicotine was used as the evaluation index to optimize purification process of Nicotine.The optimum extraction condition were as follows:enzymolysis time was 2.00 h, enzymolysis temperature was 48.50℃,cellulose enzyme amount was 2.10%,pH was 4.00.Under this condition,the yield was up to 3.320%,the relative error was smaller compared to the predicted value 3.32836%.The optimum extraction conditions were simple and stable and they were served as a reference for industrial large scale production.

Nicotine;abandoned tobacco;response surface method

S572

:A

:1000-2324(2017)02-0203-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.008

2016-10-12

:2016-11-05

国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A216);公益性行业(农业)科研专项经费(201203085)

吴映捷(1992-),女,在读硕士生,研究方向为中草药杀灭寄生虫作用.E-mail:wuyingjie0615@sina.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:xlyang@shou.edu.cn