胰岛素活性结构在水合离子液体中的稳定性

潘晓莉，李代禧，魏冬青



胰岛素活性结构在水合离子液体中的稳定性

潘晓莉1，李代禧1，魏冬青2

（1上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200093；2上海交通大学微生物代谢国家重点实验室，上海 200240）

离子液体以其独特的、可修饰的分子结构以及优良的物理化学性质被应用于蛋白质的稳定性研究。采用分子动力学模拟方法及微量热法，研究热敏性蛋白药物胰岛素在不同水质量分数下水合离子液体中活性结构的稳定性，并深入分析离子液体与胰岛素之间的相互作用及水分子与蛋白质稳定性之间的关系。研究结果表明，当水质量分数低于25.00%时，胰岛蛋白的热变性温度能保持在68℃以上。且通过模拟分析得出，含水量25.00%的水合离子液体体系中，大量阴、阳离子在胰岛蛋白表面聚集，并通过较强的静电相互作用吸附在其表面，从而对蛋白质的活性结构展现出良好的稳定效果。结合宏观实验研究及微观动力学计算阐释了不同水含量的离子液体稳定蛋白质的作用机理，并为离子液体对蛋白质的稳定作用研究提供了一种新的分析方法。

离子液体；胰岛素；水质量分数；蛋白质稳定性；分子模拟；微量热法

引 言

离子液体作为一种新型“绿色溶剂”，具有液相存在的温度范围宽、溶解范围广、蒸气压极低以及热稳定性好等特点，并被广泛应用于蛋白质的稳定性研究[1-2]。离子液体有很多种，其中咪唑类离子液体在蛋白质的溶解及稳定的应用中有着独特的优势[3]。亲水性离子液体能与水完全互溶，而且在离子液体中加入少量的水能较好地保持纯离子液体的基本特性[4-5]。有研究表明，添加25%左右的水分既能维持离子液体的溶剂环境，又不会改变体系中蛋白质的基本性质[6]。Fujita[4]小组也用实验证实了这一观点，他们用圆二色谱法研究溶解在含水30%的胆碱磷酸二氢盐（[chol][dhp]）中细胞色素C（Cyt C）的结构变化，发现Cyt C的本体构象并没有发生改变；相反地，在含水80%的[chol][dhp]中，Cyt C的基本性质发生了较大的变化。这表明含水量较少的水合离子液体对蛋白质的活性结构同样具有一定的稳定效果。

据文献[7-8]报道，1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐（[Amim][Cl]）及1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐（[Emim][OAC]）对蛋白质的溶解有着显著的效果，而关于这两种离子液体对蛋白质稳定性影响的相关研究却鲜有报道。鉴于此，本文选择不同水质量分数的水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]作为溶剂，以典型的热敏性蛋白药物胰岛素[9]作为模型蛋白，采用分子动力学模拟方法[10]（molecular dynamic, MD），从分子层面上探究水合离子液体中的水质量分数与蛋白质稳定性之间的关系及其作用机理。并通过微量热法[11]（microcalorimetry）分析在不同水质量分数的水合[Emim][OAC]中热敏性蛋白药物胰岛素热稳定性的变化，以期为功能性离子液体对蛋白质的稳定研究提供一定的指导作用。

1 实验材料和方法

1.1 试剂与仪器

猪胰岛素，白色晶体，徐州万邦金桥制药有限公司，市售分析纯；[Emim][OAC]，淡黄色液体，中国科学院兰州化学物理研究所，纯度大于97%；纳瓦级高灵敏差示扫描量热仪（Nano-DSC），美国TA Instrument。

1.2 实验方法

首先配制水质量分数分别为16.67%、20.00%、25.00%、33.33%和50.00%的5种水合[Emim][OAC]溶液。然后准确称量一定量的猪胰岛素粉末，溶解于不同含水量的水合离子液体中，使胰岛素浓度为0.30 mmol·L-1。在参比池和样品池中均注入水合离子液体，扫描温度范围为25～100℃，升温速率为1℃·min-1。扫描结束清洗后，分别将水合离子液体和溶有胰岛素的水合离子液体注入参比池和样品池，采用相同的条件进行升温扫描。采用TA NanoAnalyze 3.4.0软件进行数据记录和处理，DSC曲线的峰值点所对应的温度为蛋白质的热变性温度（值）。

1.3 分子动力学模拟

1.3.1 分子结构的准备 分子动力学研究选用两种亲水性咪唑类离子液体：[Amim][Cl]及[Emim][OAC]。离子液体的初始分子结构（见图1）均取自于Chemical数据库，并利用Gaussian 09软件包在HF/6-31G*方法下进行结构优化，得到最终的离子液体结构[12]。

胰岛素的初始结构来自蛋白质数据库（PDB ID:3inc[13]，见图2），它由A、B两条肽链共51个氨基酸组成，通过两个二硫键共价键合形成单体结构，是一种典型的球状蛋白质。

1.3.2 模拟过程 分子动力学模拟方法采用Gromacs 5.0.5[14]软件包，其中胰岛素选用Amber99sb-ildn[15]分子力场，离子液体选用Amber[16]通用分子力场，水分子选用Tip4p[17]模型。在本次模拟中，时间步长设定为2 fs，范德华相互作用和静电相互作用的截断均设为1.0 nm，并采用粒子网格埃瓦德统计方法(particle mesh Ewald, PME)[18]修正静电相互作用力，以LINCS[19]算法约束成键相互作用。

建立6 nm×6 nm×6 nm的周期性体系，分别添加不同数目的离子液体和水分子，构建水质量分数为0.00%、10.00%、16.67%、20.00%、25.00%、33.33%和50.00%共7个不同的溶液体系，所有体系均用Na+平衡其净电荷，其组成如表1所示。采用最速下降法[20]进行体系能量最小化，接着采用Berendsen[21]方法控制体系的压力，velocity-rescale[22]方法控制体系温度为300 K，在NPT系综下进行10 ns的限制性分子动力学模拟，然后在相同系综下进行150 ns的常规分子动力学模拟，得到稳定的胰岛蛋白-水合离子液体混合溶液。选取最后10 ns的模拟轨迹用于数据分析。

表1 不同水质量分数下各体系的详细组成

2 结果与讨论

2.1 胰岛素的结构差异性分析

均方根偏差[23](root mean square deviation, RMSD)可以反映特定构象与初始结构的相似程度，其值越低，表明特定构象与初始结构的差异性越小[24]。通过计算各体系中胰岛素的RMSD值（见图3）表征不同水质量分数的水合离子液体对胰岛素活性结构的稳定性影响。从图中可以看出，在水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中，当体系中水的质量分数小于或等于20.00%时，胰岛素的RMSD值均保持在0.1左右，这表明与纯离子液体相比，加入少量水的离子液体仍能稳定胰岛蛋白的分子结构。随着体系中水分子的持续加入，胰岛素的RMSD值略有升高，但当水质量分数大于25.00%时，该值的升高幅度随着水质量分数的增大明显上升，但仍低于纯水体系中胰岛素的RMSD值（0.42 nm）。这表明水分含量的大幅度增加明显降低了蛋白质的结构稳定性，但含水量较高的离子液体对蛋白质的稳定性效果仍优于纯水体系，这也从另一方面表明在一定程度上增加离子液体的含量有利于提高蛋白质的结构稳定性。

2.2 胰岛素的热稳定性分析

为了深入分析体系中的水分含量对胰岛蛋白活性结构的稳定性影响，采用Nano-DSC测量不同水质量分数的水合[Emim][OAC]中胰岛素的值，以表征不同含水量的离子液体体系中蛋白质的热稳定性变化，结果如图4所示。从图中可以看出，当体系中水的质量分数小于或等于25.00%时，胰岛蛋白的值均保持在68℃以上，说明此时体系中蛋白质仍保持较高的热稳定性。随着体系中水含量持续增多，胰岛蛋白的值呈较大程度的降低趋势，说明此时蛋白质高级结构的稳定性随之大幅度降低。这与图3得到的趋势一致，进一步表明离子液体中水含量的增加降低了胰岛素的稳定性，且说明25.00%左右含水量的水合离子液体仍对蛋白质的活性结构具有良好的保护作用。

2.3 离子液体与胰岛素之间的相互作用

离子液体通过与胰岛素之间的相互作用吸附在其表面，抑制胰岛蛋白的伸展或聚集，稳定其活性结构。图5描述了不同水质量分数下，两种离子液体和胰岛素之间的相互作用能。从中可以看出，随着体系中水分含量的增加，水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中离子液体与胰岛素之间的相互作用能逐渐减弱。且当水质量分数大于25.00%时，二者之间的相互作用减弱的幅度增大。这可能是因为当离子液体中水的质量分数较大时，体系中离子液体的浓度较低，胰岛素表面吸附的阴、阳离子较少，导致离子液体和胰岛蛋白之间的相互作用能较小，离子液体对蛋白质的稳定作用也减弱。图6描述了不同水分含量的离子液体体系中，胰岛素表面与阴、阳离子之间的径向分布函数，第1个峰的峰面积表征胰岛素表面吸附的离子液体数目。从图中可以看出，在水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中，当水质量分数小于或等于25.00%时，第1个峰的峰面积并未发生较大的变化。说明离子液体中水含量较低时，胰岛素表面吸附了一定数量的阴、阳离子以维持蛋白质三维结构的稳定。随着体系中水质量分数的增大，特别是当水含量大于或等于33.33%时，第1个峰的峰面积呈大幅度降低趋势，这表明此时胰岛素表面吸附的离子液体大幅度减少，二者之间的相互作用能也较大程度地降低（见图5），进一步验证水质量分数较大的水合离子液体体系对蛋白质的分子结构稳定效果较差。

接触数是指分子间发生相互作用的原子接触个数，该参数被用来表征两分子之间相互作用的强弱[25]。为了进一步阐释离子液体与胰岛素之间的相互作用强度对胰岛蛋白活性结构稳定性的影响，分别计算了0.35 nm范围内[26]胰岛素与阴离子和阳离子之间的接触数（如图7）。

从图7可以看出，随着体系中水的质量分数持续增加，水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中胰岛素与阴、阳离子之间的接触数均呈降低趋势。表明体系中胰岛蛋白与离子液体之间的相互作用强度随着水分含量的增加持续降低，这与图5得到的结果一致。当体系中水的质量分数小于或等于20.00%时，胰岛素与离子液体之间的接触数呈较小幅度的降低趋势，蛋白质表面仍吸附较多的阴、阳离子形成一个较为完整的离子液体保护层，从而稳定胰岛蛋白的活性结构。当水质量分数大于25.00%时，胰岛素与离子液体之间的接触数大幅度降低。这是因为当体系中水分含量较大，离子液体浓度较低时，阴、阳离子几乎以孤立的粒子状态分散在水中，只余留少量的阴、阳离子吸附在蛋白质的表面。此时体系中胰岛蛋白与离子液体之间的相互作用能也随之大幅度降低（见图5）。说明胰岛素与离子液体之间的相互作用强度较大程度地影响蛋白质的活性结构稳定性。

(a) between N3 atom on the [Amim]+and the surface of insulin in hy-[Amim][Cl]; (b) between Cl-and the surface of insulin in hy-[Amim][Cl]; (c) between N8 atom on the [Emim]+and the surface of insulin in hy-[Emim][OAC]; (d) between C1 atom on the [OAC]-and the surface of insulin in hy-[Emim][OAC]

2.4 水分子与胰岛素之间的相互作用

水分子在稳定生物大分子的活性结构方面起着关键性作用[27]。为了分析体系中水分子的含量与胰岛素稳定性之间的关系，统计了距离胰岛素表面0.35 nm范围内水分子的吸附数目，并展示于图8中。并分析不同水质量分数下，体系中胰岛素内部及胰岛素与水分子之间的氢键数目，结果如图9所示。

由图8得出，在水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]体系中，随着体系中水含量的持续增加，越来越多的水分子在胰岛素表面聚集。当水质量分数小于或等于25.00%时，胰岛素表面吸附的水分子数目以较小幅度呈上升趋势。结合图9来看，此时体系中胰岛蛋白内部的氢键数目均大于32（胰岛素初始结构的内部氢键数目为36），表明蛋白质二级结构仍较为完整。这是因为当水质量分数低于25.00%时，较多的离子液体聚集在胰岛蛋白表面形成保护层，从而稳定胰岛蛋白的二级结构。从图8还可以看出，当水质量分数大于25.00%时，体系中胰岛蛋白表面吸附的水分子数目大幅度增加。此时，胰岛蛋白与水分子之间的氢键数目大幅度上涨，相反地，胰岛素的内部氢键却呈现出一定程度的降低趋势（见图9）。这是因为当体系中胰岛素表面被水分子大面积覆盖[见图8(b)A, B, C, D]，而水分子对蛋白质的稳定作用极其有限[28]，使得离子液体含量较低的水合离子液体体系中蛋白质二级结构的稳定性逐渐降低。

A, B, C and D were shown by the PyMOL software. A and B represent the water molecules adsorbed onto the surface of insulin in the system of hydrated [Amim][Cl] at water mass fractions as 33.33% and 50.00% respectively; C and D represent the water molecules adsorbed onto the surface of insulin in the system of hydrated [Emim][OAC] at water mass fractions as 33.33% and 50.00% respectively; The linear model part represents the molecular structure insulin; The spherical model part represents the molecular structure of water

3 结 论

离子液体对蛋白质稳定性的作用机制十分复杂，阴阳离子的特性、蛋白质的种类[29]以及离子液体的浓度均会影响蛋白质的稳定效果。本文利用分子动力学模拟方法及差示扫描量热法，从分子间相互作用及热力学性质方面研究离子液体中的水分含量与胰岛蛋白活性结构稳定性之间的关系。结果表明：当水合离子液体中的水质量分数小于25.00%时，胰岛蛋白能保持较高的热稳定性。此时，体系中仍有较多离子液体主要通过静电相互作用紧密吸附和覆盖在胰岛素表面，形成保护层包裹住蛋白质，进而对胰岛蛋白的活性结构展现出良好的稳定效果。

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Bioactive structural stability of insulin in hydrated ionic liquids

PAN Xiaoli1, LI Daixi1, WEI Dongqing2

(1Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;2State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Ionic liquids, which have unique, modulated molecular structure and excellent physicochemical properties, are applied to study the structural stability of protein. In the present study, insulin was selected as a heat sensitive protein medicine in order to investigate the bioactive structural stability of protein in ionic liquids with different mass fractions of water by using molecular dynamics simulation and microcalorimetry. In order to analyze thoroughly the relationship between the content of water molecules and the protein stability, the interaction energy between the ionic liquids and the insulin was calculated. Finally, the experimental results show that the thermal denaturation temperature of insulin is more than 68℃ when the mass fraction of water is less than 25.00%. Moreover, in the hydrated ionic liquids at the water content as 25.00%, a large number of cations and anions are adsorbed on the surface of insulin owing on the strong electrostatic interaction between the insulin and the ions, which reveals the stabilizing effect of hydrated ionic liquids. Generally, macroscopic experimental study and microscopic dynamics calculation, as attempted by this research, provide a new analytical method to interpret the stabilization mechanism of ionic liquids with different water content for protein.

ionic liquids; insulin; mass fraction of water; stability of protein; molecular simulation; microcalorimetry

10.11949/j.issn.0438-1157.20161499

O 6-39

A

0438—1157（2017）05—2035—07

李代禧。

潘晓莉（1991—），女，硕士研究生。

上海市重点学科项目(T0503, P0502)；上海市“创新行动计划”国际科技合作项目(12430702000)；上海市自然科学基金项目(12ZR1420400)；上海市联盟计划项目 (11XSY23)。

2016-10-26收到初稿，2016-12-21收到修改稿。

2016-10-26.

Prof. LI Daixi,dxli75@126.com

supported by the Leading Academic Discipline Project of Shanghai (T0503, P0502), “Innovation Action Plan” International Science and Technology Cooperation Project of Shanghai (12430702000), the Natural Science Foundation of Shanghai (12ZR1420400) and Alliance Program of Shanghai (11XSY23).