灰树花液态发酵培养基优化研究

吴 强 胡宝坤

（1威高泰尔茂（威海）医疗制品有限公司，山东威海264210；2青岛绿十字高邦职业安全咨询事务所有限公司，山东青岛266011）

真菌多糖以其独特的生物活性而引起人们越来越多的关注。灰树花（Grifola frondosa）是亚热带至温带森林中的一种大型药、食兼用珍稀真菌。灰树又名贝叶多孔菌、栗子蘑、莲花菌，日本俗名舞茸。鲜灰树花肉质脆嫩，味如鸡丝，营养丰富，且含有生物活性物质，具有独特的营养和药用价值，成为当前的研究热点。这种传奇的菇类直到20世纪80年代中期才人工栽培成功，此后以日本为主的科学家在化学、生化学、药理学等方面对灰树花进行了广泛的研究，证明了灰树花是非常有价值的药食两用菇类，特别是从灰树花中提取的最有效活性成分灰树花D-fraction具有极强的抗癌功效[1-6]。

目前有关灰树花的产品大多都是从子实体中提取得到的，虽然灰树花人工栽培技术已经很成熟，但人工栽培周期长，而液态发酵培养菌丝体要比固态培养子实体简单迅速，同时深层发酵得到的灰树花菌丝体不但具有和子实体相当的营养及药用效果，还可得到胞外多糖等子实体所不具备的营养保健成分[7-8]。因此采用深层发酵方法生产灰树花菌丝体可以部分替代灰树花子实体，降低生产成本。灰树花属多孔菌属，在液态深层培养条件下代谢能力强，是多糖富集的良好载体。笔者对灰树花发酵条件及对影响灰树花深层发酵得胞外多糖的因素进行研究。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株灰树花菌株GWH，购自华中农大食用菌科研教学基地。

1.2 试验方法

1.2.1 碳源对灰树花深层发酵的影响 选择葡萄糖、蔗糖、淀粉、马铃薯+葡萄糖分别作为发酵培养基的碳源进行考察：葡萄糖80 g/L、蔗糖80 g/L、淀粉80 g/L、马铃薯180 g/L（取浸提液）+葡萄糖20 g/L。

培养基：碳源、豆饼粉10 g/L（降解浸提液）、麸皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH 6.5。每种配方重复3次，结果取无显著差异的数值的平均值。

1.2.2 氮源对灰树花深层发酵的影响 选择豆饼粉、蛋白胨及谷氨酸发酵废液（用味精代替）分别作为发酵培养基的氮源进行考察：豆饼粉10 g/L（降解浸提液）、蛋白胨10 g/L、味精10 g/L。

培养基：氮源、马铃薯180 g/L（取浸提液）+葡萄糖20、麸皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH6.5。每种配方重复3次，结果取无显著差异的数值的平均值。

1.2.3 发酵培养基的优化 采用L9（34）正交表，固定其它的因素，以筛选出的碳源、氮源以及pH作为因子，第四列为空列（表1），进行正交试验（表2），以确定其最佳培养基配方。

表1 灰树花深层发酵培养基优化正交试验因素水平

其它成分：麸皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L。

1.2.4 发酵培养基的验证 按1.2.3试验方法确定的最佳培养基配方进行三批发酵试验，以对发酵条件进行验证。

1.3 测定方法

1.3.1 灰树花菌丝体生物量测定 取1.3.2.1离心后沉淀物无菌水反复冲洗后，60℃烘干至恒重，电子天平称重。

1.3.2 多糖的测定方法 采用苯酚-硫酸法[9]，以葡萄糖为标准品。

1.3.2.1 胞外多糖的测定 取5 mL发酵液，4000 r/min离心15 min，上清液加3倍酒精，4℃冰箱中静置过夜完全沉淀后加去离子水适度稀释，测定胞外多糖含量。

1.3.2.2 胞内多糖的测定 取1.3.1的干菌丝加入30 mL去离子水在80℃温度下蒸煮3 h后过滤，反复2次，合并2次上清液，浓缩至30 mL并冷却至室温，加入3倍酒精，4℃冰箱中静置过夜完全沉淀后加去离子水适度稀释，测定胞内多糖含量。

1.3.2.3 标准曲线的绘制 按表3量取葡萄糖标准液并稀释成相应浓度，在490 nm波长下测定吸光度值，绘制标准曲线。

表2 L 9（34）正交表

表3 多糖测定标准曲线绘制表

所得标准曲线如图1。

图1 灰树花多糖测定标准曲线

1.3.2.4 样品含量测定 吸取样品液1.0 mL（相当于40μg左右的多糖），按上述显色操作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。

1.4 培养方法种子培养液按10%接种量接入液态培养基，26℃，150 r/min，培养10 d。

2 结果与分析

2.1 碳源对灰树花深层发酵产多糖及菌丝生长的影响不同碳源对灰树花深层发酵产多糖及菌丝生长影响的结果见表4。结果表明：葡萄糖和蔗糖作为碳源的培养基胞外多糖产量较低，最适于灰树花发酵产糖及菌丝体生长的碳源为马铃薯+葡萄糖；葡萄糖和马铃薯+葡萄糖作为碳源的培养基利于菌丝体生长，胞内多糖含量高。但在发酵过程中，淀粉和马铃薯+葡萄糖中所含的多糖一部分被灰树花菌丝体利用，另一部分被水解为其它糖类，可能会使测定结果偏高。综合各方面的因素，采用马铃薯+葡萄糖作为碳源最为合适。

表4 不同碳源对灰树花深层发酵产胞内外多糖及菌丝生长的影响

表5 不同氮源对灰树花深层发酵产胞内外多糖及菌丝生长的影响

2.2 氮源对灰树花深层发酵产多糖及菌丝生长的影响不同氮源对灰树花深层发酵产多糖及菌丝生长影响的结果见表5。结果表明：豆饼粉、蛋白胨、味精对灰树花深层发酵产胞外多糖及菌丝生长的影响不大，其中豆饼粉稍有利于菌丝体的生长，而味精作氮源时胞外多糖稍高，考虑成本及原料来源，采用豆饼粉作为灰树花深层发酵优化试验氮源。

2.3 发酵培养基的优化

以胞外多糖为指标的正交试验结果如表6所示。

表6 灰树花液态发酵培养基优化正交试验结果

表6 方差分析

由方差分析初步可知，影响灰树花深层发酵得胞外多糖的因素主次顺序为：A＞C＞B＞D，即碳源影响显著，最佳组合为A3B2C2D，因B因素间差异不显著，考虑到节约原料，因此选择B因素最佳水平为1，所以最佳组合为A3B1C2，即最佳发酵培养基：马铃薯225 g/L、葡萄糖25 g/L、豆饼粉6 g/L、麸皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L，pH6.5。

2.4 发酵培养基的验证三批验证试验结果如表7。由表7结果可知，该培养基配方适合用于灰树花的深层发酵培养产多糖。

表7 三批验证试验结果

3 结 论

试验筛选出最适于灰树花发酵产多糖及菌丝体生长的碳源为马铃薯+葡萄糖，氮源为豆饼粉；得到最佳培养基配方为马铃薯225 g/L、葡萄糖25 g/L、豆饼粉6 g/L、麸皮20 g/L（浸提液）、KH2PO41 g/L、CaCl21 g/L、MgSO42 g/L、VB10.2 g/L、pH6.5。