丹皮酚对皮质下缺血性血管性痴呆小鼠认知功能的保护作用及机制

王浩+李中春++王百辰++张震中

[摘要] 目的 探討丹皮酚对皮质下缺血性血管性痴呆（subcortical ischemic vascular dementia， SIVD）小鼠的认知功能的作用及机制。 方法 小鼠随机分为假手术组、模型组、丹皮酚低剂量与高剂量组，以永久性结扎小鼠单侧颈总动脉建立皮质下缺血性血管性痴呆模型，假手术组只分离右颈总动脉，不进行血管结扎。期间每天给予生理盐水或丹皮酚（20、40 mg/kg），以开放场实验、水迷宫等方法检测小鼠行为学变化，以分光光度计法检测海马组织匀浆胆碱乙酰转移酶（ChAT）、乙酰胆碱酯酶（AChE）活性。 结果 与假手术组比较，手术组小鼠的运动量没有改变（P>0.05）。与模型组比较，其中丹皮酚高剂量（40 mg/kg）能明显延长SIVD小鼠在中心区活动中的探索时间，并改善SIVD小鼠学习记忆能力下降，表现为丹皮酚（40 mg/kg ）治疗后小鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期缩短，穿越原平台时间以及穿台次数均增多（P<0.05）。此外，与模型组比较，丹皮酚（40 mg/kg）治疗还能降低SIVD小鼠海马组织AChE活性，升高ChAT活性（P<0.05）。而与模型组比较，丹皮酚（20 mg/kg）治疗则各指标没有显著性差异（P>0.05）。 结论 丹皮酚对SIVD小鼠认知功能下降具有保护作用，其机制可能与增加胆碱递质合成，减少胆碱递质分解有关。

[关键词] 海马；皮质下缺血性血管性痴呆；丹皮酚；胆碱乙酰转移酶；乙酰胆碱酯酶

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）35-0031-05

Protective effect and mechanism of paeonol on cognitive function in the mice with subcortical ischemic vascular dementia

WANG Hao LI Zhongchun WANG Baichen ZHANG Zhenzhong

Department of Neurology， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310012， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of paeonol on cognitive function in the mice with subcortical ischemic vascular dementia（SIVD）. Methods The mice were randomly divided into sham operation group， model group， paeonol low dose group and paeonol high dose group. The model of subcortical ischemic vascular dementia was established by permanent ligation of unilateral common carotid arteries in mice. In the sham operation group， only the right common carotid artery was isolated and no vascular ligation was performed. During the period， the mice were daily given normal saline or paeonol（20， 40 mg/kg）. The behavioral changes of mice were detected by open field test and water maze. The activities of homogenate choline acetyltransferase（ChAT） and acetylcholinesterase（AChE） in hippocampus tissue were detected by spectrophotometer. Results Compared with the sham operation group， there was no change in the exercise amount of the mice in the operation group （P>0.05）. Compared with the model group， paeonol （40 mg/kg） could significantly prolong the exploration time of SIVD mice in the central area， and improve the decreasing learning and memory ability of SIVD mice. It shown that the escape latency of Morris water maze was reduced in the mice after paeonol treatment （40 mg/kg）， and the crossing platform time and the number of crossing were increased （P<0.05）. In addition， compared with the model group， paeonol（40 mg/kg） could decrease AChE activity and increase ChAT activity in hippocampus of SIVD mice（P<0.05）. Compared with the model group， there was no significant difference in all indicators in paeonol （20 mg/kg） treatment（P>0.05）. Conclusion Paeonol has a protective effect on the decline of cognitive function in SIVD mice. The mechanism may be related to the increase of synthesis of cholinergic neurotransmitters and the decrease of decomposition of cholinergic transmitter.

[Key words] Hippocampus； Subcortical ischemic vascular dementia （SIVD）； Paeonol； Choline acetyltransferase （ChAT）； Acetylcholinesterase （AChE）

血管性痴呆（vascular dementia，VD） 是由各种脑血管因素造成脑组织损害继而引起的获得性智能障碍综合征，是一种慢性进行性疾病，发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）[1]。其中，皮质下缺血性血管性痴呆（subcortical ischemic vascular dementia， SIVD）是VD中的一种常见亚型，占全部VD的50%以上，临床表现为脑皮质下多发性的腔隙性脑梗死及缺血性病变[2]。目前SIVD的确切发病机制尚不清楚，临床上胆碱酯酶抑制剂、血管扩张药等通不同的作用机制发挥一定程度的保护作用，但是尚无特效治疗药物[3，4]。既往实验证明，丹皮酚制剂具有一定的神经保护作用[5-9]。本文采用永久性结扎右颈总动脉（right unilateral common carotid arteries occlusion，rUCCAO）方法建立小鼠SIVD模型來探讨丹皮酚对SIVD小鼠认知功能的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组

C57BL/6 小鼠，体重22～28 g，购自浙江省实验动物中心[合格证0002868，许可证号SCXK（浙）2003-0001]，共40只。小鼠饲养在（22±1）℃、12 h明暗循环的环境下，自由饮食摄水。行为学实验均安排在10：00～17：00进行。小鼠随机分为假手术（Sham）组、皮质下缺血性血管性痴呆（SIVD）组、丹皮酚（Pae）低、高剂量治疗组，每组10只。

1.2药品与试剂

丹皮酚注射液（10 mg/支） 购自上海第一生化药业公司。乙酰胆碱酯酶（AChE）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）以及蛋白定量检测试剂盒购自南京建成生物公司。

1.3 动物模型的建立

参照文献[4，10]，使用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，颈部皮肤消毒后，做皮肤正中切口，钝性分离出小鼠右颈总动脉，采用手术缝线永久性结扎右颈总动脉，随后逐层缝合小鼠颈部的肌肉皮肤。将小鼠术后放入保温箱中直至其苏醒，术后常规对小鼠进行抗感染治疗。假手术组只分离右颈总动脉，不进行血管结扎。丹皮酚低剂量与高剂量治疗组小鼠从术后第1天分别开始腹腔注射丹皮酚注射液（20或40 mg/kg），每天1次，共注射28 d；而模型组与假手术组小鼠分别注射等容量的生理盐水。手术后第29天对小鼠进行开放场行为学检测，术后第30天开始进行水迷宫实验。

1.4开放场实验

用于检测小鼠进入开阔环境后的自发活动和探索能力的变化。在实验手术后第29 天时把小鼠放进自发活动监测箱中，实时记录小鼠10 min活动的情况，采用视频跟踪分析系统进行录象，并同时跟踪测定小鼠的活动距离、中心区的活动时间。实验完成后，采用自发活动视频分析软件系统分析小鼠活动的各项参数。

1.5水迷宫实验

用于测量小鼠学习记忆能力，迷宫上方安置带有显示系统的摄象机，同步记录小鼠运动轨迹，数据采集和分析软件记录相关数据及图象结果。整个实验过程分为定位航行实验和空间搜索实验两部分。

1.5.1 定位航行实验 术后第30天开始对各组小鼠进行Morris水迷宫实验。实验历时5 d，实验前小鼠自由游泳2 min，进行适应性训练。正式实验每天训练1次，每次120 s，记录每只小鼠寻找并跳上平台所需要的时间即逃避潜伏期（Escape latency）。如果在120 s内小鼠没有寻找到平台，由实验者将其引导至平台，逃避潜伏期记为120 s。每次训练完迅速擦干小鼠，置于加热器旁，防止小鼠低体温。每只小鼠随机从不同象限分别放入水中，每天每个象限均放入1次，用于计算每天逃避潜伏期。

1.5.2 空间搜索实验 用于测量小鼠的记忆保持能力。实验第6天撤去平台，从任意一个入水点将小鼠放入水中，在水中游泳120 s，分别测量在此期间：小鼠在目标象限以及其他象限游泳的时间；穿越目标（原平台位置）次数。

1.6脑组织ChAT、AChE 活性的测定

待行为学检测全部结束后，麻醉小鼠后迅速取脑，在冰上分理出海马组织，用于制作10%的组织匀浆，4℃ 3000 rpm，离心10 min，取此上清液备用。ChAT 的测定是以乙酰辅酶A和胆碱为底物，检测324 nm处吸光度；AChE 水解乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，检测412 nm 处吸光度，以此分别用于计算ChAT、AChE 活性。操作具体步骤严格按照检测试剂盒的说明书进行。

1.7统计学方法

采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1丹皮酚对rUCCAO诱导的SIVD小鼠开放场实验的影响

手术后29 d小鼠运动量检测发现，与假手术组相比，SIVD组小鼠的总活动距离没有显著性差异，并且丹皮酚（20、40 mg/kg）给药对小鼠的总活动距离也没有影响，因此可以进行其他受运动量影响的认知功能实验。开放场实验中，小鼠在中间区域停留时间越长，说明其探索能力越强。通过分析结果显示，与假手术组相比，SIVD模型组动物在中间区域停留时间明显降低（P<0.01），而丹皮酚高剂量（40 mg/kg）能明显逆转由手术引起的小鼠在中间区域停留时间的降低（P<0.05）。见表1。

2.2 丹皮酚对rUCCAO 诱导的SIVD小鼠Morris水迷宫实验的影响

2.3.1 定位航行实验 随着训练的增加，各组小鼠的逃避潜伏期（Escape latency）均有程度不同的缩短。与假手术组相比，模型組小鼠的逃避潜伏期显著增加（P<0.01）；而与SIVD模型组比较，丹皮酚高剂量（40 mg/kg）治疗组小鼠逃避潜伏期明显缩短，差异具有显著性（P<0.05），见表2。

2.3.2 空间搜索实验 与假手术组相比，SIVD模型组穿越原平台象限的时间明显缩短，穿台次数明显减少（P<0.01）；而与SIVD模型组比较，丹皮酚高剂量（40 mg/kg ）组穿越原平台象限的时间明显延长，穿台次数明显增加，差异具有显著性（P<0.05），见表3。

2.3丹皮酚对rUCCAO 诱导的SIVD小鼠海马组织中ChAT、AChE活性的影响

与假手术组比较，SIVD模型组小鼠海马组织匀浆中AChE的活性明显升高，ChAT的活性明显下降（P<0.01）。而与SIVD模型组比较，丹皮酚高剂量（40 mg/kg）治疗组能够显著升高SIVD小鼠海马组织ChAT活性，并降低SIVD小鼠海马中AChE活性（P<0.05），见表4。

3 讨论

SIVD是一组以小血管病变为主要病因、以皮质下多发性腔隙性梗死和脑白质病变为主要损害的缺血性脑血管病，是引起血管性认知功能障碍最常见的亚型。不同于阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）、路易小体痴呆（Dementiawith Lewy bodies，DLB）及额颞叶痴呆（fronto temporal dementia，FTD），SIVD的临床及病理实质改变主要集中在大脑白质，表现为认知功能障碍和胶质细胞激活，而不在于神经元[4，11，12]。目前常用的VD实验动物模型主要是双侧颈总动脉永久结扎模型（2-VO）以及改良的反复缺血再灌注模型等，但这些对于建立小鼠模型，死亡率相对较高、部分有运动系统损伤、认知功能改变差异较大[13，14]。建立易复制的理想的动物模型对探明血管性痴呆发生机制以及后续的疗效筛选非常重要。文献采取永久性结扎右颈总动脉（rUCCAO）方法建立小鼠模型，报道该模型操作相对简单、死亡率低并且易于重复，对小鼠的运动系统也没有明显损伤，因此可以进行后续的行为学检测[4，11]。研究表明rUCCAO 诱导的慢性缺血会损伤小鼠的空间和非空间学习记忆，可引起模型小鼠水迷宫实验中学习记忆能力的下降及开放场实验探索能力的下降等，可以更好的模拟临床SIVD 病人的认知功能障碍[4，14]。

目前SIVD疾病的发病机制还不清楚，临床对SIVD的治疗主要是对症治疗，中枢胆碱能神经通路损伤和乙酰胆碱（ACh）释放减少是脑缺血后认知障碍的一个重要促进因素[15，16]。研究表明VD 患者中枢胆碱能神经功能显著降低，并且中枢神经系统胆碱能的活性与其临床症状是密切相关的[16]。临床及动物实验也表明包括多奈哌齐在内的胆碱酯酶抑制剂能够明显缓解痴呆的症状，改善生活质量[16，17]。胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）催化乙酰辅酶A 和胆碱生成ACh，ChAT活性能间接反映ACh在脑中合成的变化；而AchE 是ACh的水解酶，催化ACh分解成胆碱和乙酸，其活性能间接反映ACh在脑中分解的改变，两者共同维持着体内ACh的动态平衡[15-18]。通过增加ACh的合成，或者抑制其分解，或者直接作用于胆碱能神经的受体，均可调节胆碱能神经功能，改善胆碱能神经功能下调所造成的认知功能障碍[16-18]。但是胆碱酯酶抑制剂存在较多的胃肠道反应，使其临床使用受到了一定的限制。如何减轻该类药的副作用或者研究其他药物、发现新的治疗靶点，对于SIVD的治疗具有迫切的现实意义[19]。

随着传统中医药的创新性用途的不断开发研究，从祖国传统中草药中寻找有效成分用于治疗神经退行性疾病及改善认知损害等方面成为研究热点。丹皮酚是从毛茛科植物牡丹皮和萝藦科植物徐长卿的全草等中提取的一种呈白色针状结晶的酚类化合物，众多体内外研究表明丹皮酚的药理作用十分广泛：丹皮酚能够通过抗氧化应激、抗炎、减轻Ca2+超载、增加侧支循环等机制减轻心脏与脑缺血再灌注损伤，并且能缓解AD大鼠、PD小鼠、血管性认知障碍小鼠及焦虑抑郁小鼠的认知功能障碍及神经损伤[5-9，20，21]。但是对于rUCCAO方法建立SIVD小鼠尚无相关报道。

本实验采用SIVD小鼠模型，用于研究丹皮酚对SIVD小鼠认知功能的影响。在本研究，丹皮酚（40 mg/kg）能明显逆转SIVD小鼠在开放场中间区域停留时间的降低，并且在水迷宫实验中中，与SIVD模型组比较，经过丹皮酚（40 mg/kg）治疗后SIVD小鼠的逃避潜伏期明显缩短，并且在目标（原平台）象限中停留的时间及穿台次数都明显增多。同时，经丹皮酚（40 mg/kg）治疗后，SIVD小鼠脑内ChAT活性升高，AChE活性下降，改善了胆碱能系统的功能，调节了Ach代谢，有利于改善SIVD小鼠的症状。而与模型组比较，丹皮酚（20 mg/kg）治疗上述各指标均无统计学意义（P>0.05），表明丹皮酚的上述改善SIVD小鼠症状的作用与剂量也有一定的关系。当然丹皮酚的最适剂量仍需要进一步实验研究。

综上所述，通过本次实验发现丹皮酚为促进学习记忆、改善认知功能障碍的中药活性成分，其作用机制可能涉及到改善海马胆碱能系统的功能。本研究提示丹皮酚在治疗皮质下缺血性血管性痴呆方面具有潜在的应用价值，但是其改善认知功能的具体机制仍有待于进一步研究。

[参考文献]

[1] Kalaria RN，Maestre GE，Arizaga R，et al. Alzheimer's disease and vascular dementia in developing countries：Prevalence，management，and risk factors[J]. Lancet Neurol，2008，7（9）：812-826.

[2] Tomimoto H. Subcortical vascular dementia[J]. Neurosci Res，2011，71（3）：193-199.

[3] Roh JH，Lee JH. Recent updates on subcortical ischemic vascular dementia[J]. J Stroke， 2014，16（1）：18-26.

[4] Ma J，Xiong JY，Hou WW，et al. Protective effect of carnosine on subcortical ischemic vascular dementia in mice[J].CNS Neurosci Ther，2012，18（9）：745-753.

[5] Zhao Y，Fu B，Zhang X，et al. Paeonol pretreatment attenuates cerebral ischemic injury via upregulating expression of pAkt，Nrf2，HO-1 and ameliorating BBB permeability in mice[J]. Brain Res Bull，2014，109：61-67.

[6] 王浩，耿趙铭，呙登俊，等. 丹皮酚对血管性认知障碍小鼠认知功能的保护作用[J]. 温州医科大学学报，2014， 44（10）：708-711.

[7] Shi X，Chen YH，Liu H，et al. Therapeutic effects of paeonol on methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine/probenecid-induced Parkinson's disease in mice[J]. Mol Med Rep，2016，14（3）：2397-2404.

[8] Zhou J，Zhou L，Hou D，et al. Paeonol increases levels of cortical cytochrome oxidase and vascular actin and improves behavior in a rat model of Alzheimer's disease[J]. Brain Res，2011，1388：141-147.

[9] Tao W，Wang H，Su Q，et al. Paeonol attenuates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice[J]. Psychiatry Res，2016，238：116-121.

[10] Yoshizaki K，Adachi K，Kataoka S，et al. Chronic cerebral hypoperfusion induced by right unilateral common carotid artery occlusion causes delayed white matter lesions and cognitive impairment in adult mice[J]. Exper Neurol，2008，210（2）：585-591.

[11] Choi BR，Kim DH，Back DB，et al. Characterization of white matter injury in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion[J]. Stroke，2016，47（2）：542-547.

[12] Shindo A，Liang AC，Maki T，et al. Subcortical ischemic vascular disease：Roles of oligodendrocyte function in experimental models of subcortical white-matter injury[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2016，36（1）：187-198.

[13] Jiwa NS，Garrard P， Hainsworth AH. Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment：A systematic review[J]. J Neurochem，2010，115（4）：814-828.

[14] Shibata M，Yamasaki N，Miyakawa T，et al. Selective impairment of working memory in a mouse model of chronic cerebral hypoperfusion[J]. Stroke，2007，38（10）：2826-2832.

[15] Servello A，Andreozzi P，Bechini F，et al. Effect of AChE and BuChE inhibition by rivastigmin in a group of old-old elderly patients with cerebrovascular impairment（SIVD type）[J]. Minerva Med，2014，105（2）：167-174.

[16] Xiao Y，Guan ZZ，Wu CX，et al. Correlations between cholinesterase activity and cognitive scores in post-ischemic rats and patients with vascular dementia[J]. Cell Mol Neurobiol， 2012，32（3）：399-407.

[17] Kwon KJ，Kim MK，Lee EJ，et al. Effects of donepezil， an acetylcholinesterase inhibitor，on neurogenesis in a rat model of vascular dementia[J]. J Neurol Sci，2014，347（1-2）：66-77.

[18] Zhao RR，Xu F，Xu XC，et al. Effects of alpha-lipoic acid on spatial learning and memory，oxidative stress，and central cholinergic system in a rat model of vascular dementia[J]. Neurosci Lett，2015，587：113-119.

[19] Chen Z，Liang X，Zhang C，et al. Correlation of thyroid dysfunction and cognitive impairments induced by subcortical ischemicvascular disease[J]. Brain Behav，2016， 6（4）：e00452.

[20] Ma L，Chuang CC，Weng W，et al. Paeonol protects rat heart by improving regional blood perfusion during no-reflow[J]. Front Physiol，2016，7：298.

[21] Li H，Song F，Duan LR，et al. Paeonol and danshensu combination attenuates apoptosis in myocardial infarcted rats by inhibiting oxidative stress：Roles of Nrf2/HO-1 and PI3K/Akt pathway[J]. Sci Rep，2016，6：23693.

（收稿日期：2016-08-20）