一株中度嗜盐菌新种LYG2#的分离与鉴定

纪昌伟 陆宇豪 杜梦 王子元

（江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州 221116）

摘要[目的]对一株从连云港青口卤水中分离纯化出的细菌LYG2#进行分类学鉴定。[方法]通过16S rRNA基因序列比对、系统发育分析和一系列生理生化指标测定对该细菌LYG2#进行鉴定。[结果]该菌为革兰氏阴性菌，菌落形态为圆形，粉红色。电镜下观察菌体为螺旋状，长1.50～2.00 μm，宽0.24 μm。LYG2#最适生长盐浓度为9.6%，最适生长温度为32 ℃，最适pH为8.5。通过16S rRNA基因序列比对，发现其与Spiribacter salinus M19-40T的相似度最高，为95.98%。菌株LYG2#在中国科学院的保藏号为CGMCC 1.12136，GenBank序列登录号为JQ087462。[结论]分离的菌株LYG2#为一株中度嗜盐菌，是Spiribacter属的一个新种资源。

关键词中度嗜盐菌；分类学鉴定；新种；连云港青口水样

中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0005-03

Isolation and Identification of a Moderately Halophilic Bacterium LYG2#

JI Changwei， LU Yuhao， DU Meng et al

（School of Life Science， Jiangsu Normal University， Xuzhou， Jiangsu 221116）

Abstract[Objective] To identify a strain LYG2# isolated from Lianyungang Qingkou Salinas. [Method] We identified the strain LYG2# by means of 16S rRNA gene sequence blast， phylogenetic analysis and the determination of physiological and biochemical characteristics. [Result] The bacteria was gram negative， appeared pink and round colony. Strain LYG2# was spiral， the length of the bacteria was from 1.50 to 2.00 μm， and the width was 0.24 μm. The optimum salt concentration， temperature and pH were 9.6%， 32℃ and 8.5. By 16S rRNA gene sequence blast， the 16S rDNA of the strain LYG2# and Spiribacter salinus M1940T showed the highest similarity， was 95.98%. Strain LYG2# was preserved at China General Microbiological Culture Collection Center， the number was CGMCC 1.12136， the GenBank accession number for 16S rDNA of the strain was JQ087461. [Conclusion] The bacteria isolated was a moderately halophilic bacterium， and was a new species of the Spiribacter genus.

Key wordsModerately halophilic bacterium；Identify；New species；Lianyungang Qingkou Salinas

地球上存在著各种各样的高盐环境，它们大部分是由海水的蒸发而形成，钠离子和氯离子是此类环境中的主要离子，其pH接近中性到弱碱性。嗜盐菌是生活在此类高盐环境中的主要微生物，这类微生物基因型独特，生理机制和代谢产物也不同于一般细菌，已经逐渐适应了这种高盐环境[1-3]。我国有各种各样的高盐环境，孕育了丰富的嗜盐菌。

嗜盐菌种类繁多，根据目前受到普遍认可的Kushner[4]的分类系统，按照嗜盐菌对不同NaCl浓度的需求，大致可分为非嗜盐细菌（<0.2 mol/L NaCl）、轻度嗜盐菌（0.2～<0.5 mol/L NaCl）、中度嗜鹽菌（0.5～<2.5 mol/L NaCl）、极端嗜盐菌（2.5～5.2 mol/L NaCl）以及耐盐菌。中度嗜盐菌生长的盐浓度范围相对较宽，其生长又对盐有着绝对的依赖性，加之比较容易分离培养等优点，引起了人们的广泛关注，关于中度嗜盐菌的相关报道也越来越多。

笔者从连云港青口水样中分离纯化出一株嗜盐细菌LYG2#，并对其进行了分类学鉴定。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌。菌株LYG2#从连云港青口（119°12′～119°15′ E，34°40′～34°42′ N）卤水中分离得到。

1.1.2试剂。DNA Marker、限制性内切酶等购自Fermentas 公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.1.3主要仪器。恒温摇床、恒温培养箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统。

1.1.4培养基。10% MGM培养基（1 L）：30%人工海水333 mL，蛋白胨5 g，酵母膏1 g。配制固体培养基时加1.5%琼脂。其他盐浓度的培养基采用相同方法配制。

1.2方法

1.2.1菌株的分离与纯化。用20%的人工海水，按照10-2、10-3、10-4梯度稀释样品，吸取0.1 mL稀释液涂10% MGM平板，在恒温培养箱中37 ℃倒置培养。总培养时间为30 d左右，在此期间注意观察，根据形态、颜色、大小对平板上生长的单菌落进行筛选。为了确保菌种的纯度，每个单菌落划线3次，纯化后的细菌分别保存于-80 ℃和室温。将斜面保存的细菌寄存到中国科学院微生物保存中心进行保藏。

1.2.2形态学鉴定。将菌株LYG2#在10% MGM固体培养基上划线培养，获得单菌落，观察其菌落形态，并进行革兰氏染色和扫描电镜观察。

1.2.3生理生化指标的鉴定。生化和酶学鉴定参考东秀珠等[5]的《常见细菌系统鉴定手册》，测定菌株的各种特征。抗生素敏感试验参照美国国家临床实验室标准委员会推荐的K-B法（纸片扩散法）[6]。

1.2.4化学指标的测定。菌株基因组G+C含量的测定采用热变性法[7]，用Thermo scientific Evolution 300測定Tm值，细菌DNA（G+C）mol%=（Tm - 69.3）×2.44。脂肪酸、呼吸醌测定由德国DSMZ公司完成。

1.2.5

菌株最适生长环境的测定。

1.2.5.1最适生长盐浓度。将菌株LYG2#等量的菌液分别接种于盐浓度为5.6%、6.4%、8.0%、9.6%、11.2%、12.8%、14.4%、16.0%、17.6%、19.2%的MGM液体培养基中，37 ℃摇床培养。

1.2.5.2最适生长温度。将菌株LYG2#等量的菌液接种于最适盐浓度的MGM液体培养基中，分别于22、28、32、37、42、46、50 ℃条件下摇床培养。

1.2.5.3最适生长pH。将菌株LYG2#等量的菌液接种于最适盐浓度，pH为6.5、6.8、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的MGM液体培养基中，于最适温度下摇床培养。

1.2.6菌株16S rRNA 基因序列分析以及系统进化树构建。依据总基因组提取方法获得基因组DNA，利用通用引物对（B27F：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，B1492R：CTACGGTTA CCTTGTTACGAC）对菌株16S rRNA 基因进行扩增。 PCR扩增体系：10×PCR缓冲液5.0 μL，B27F（10 μmol/L）2.0 μL，B1492R（10 μmol/L）2.0 μL，dNTPs（5 mmol/L）2.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，Taq DNA聚合酶（5.0 U/μL）0.5 μL，DNA模板 2.0 μL，加水至50.0 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经TA克隆，送上海生工生物技术有限公司进行测序，测序引物是通用引物T7和SP6。将测序得到的菌株16S rDNA序列到GenBank和EzTaxon server 2.1数据库上进行同源性搜索，获得序列同源性高的相关菌株的16S rDNA序列。用CLUSAL X 1.83软件包进行序列比对。通过MEGA version 4.1软件，使用Neighbour-joining法[8]构建系统发育树。通过1 000次独立取样确定其Bootstrap值。

2结果与分析

2.1菌株的采集与分离

细菌分离自连云港青口卤水样中，命名为LYG2#。该菌株已保存于CGMCC，保藏号为CGMCC1.12136。

2.2菌株的形态学特征

菌株LYG2#接种于10% MGM平板，生长6 d后的菌落形态为圆形，粉红色小菌落，菌落凸起，表面光滑，边缘整齐。革兰氏染色为阴性，电镜下观察菌体为螺旋状，长1.50～2.00 μm，宽约0.25 μm（图1）。

2.3菌株的生理生化特性

菌株LYG2#氧化酶和接触酶反应呈阳性；MR和VP反应呈阴性；硝酸还原的生化反应呈阴性。此外，该菌株不产生吲哚和H2S；表1列出了菌株LYG2#具体的碳源利用和糖醇产酸反应的结果；表2列出了菌株LYG2#抗生素敏感试验的结果。

2.4菌株的化学特性

LYG2#基因组G+C含量为66.6%，经德国DSMZ公司测定菌株LYG2#合成的主要脂肪酸为C18∶1 ω7C（44.54%）、C16∶0（14.27%）、C19∶0 CYCLO ω8C（1216%）和C12∶0（4.76%）。主要呼吸醌为辅酶Q8。

2.5菌株的最适生长环境

2.5.1菌株的最适生长盐浓度。LYG2#可耐受的盐浓度范围很广，最佳生长盐浓度为9.6%（图2）。

2.5.2菌株的最适生长温度。LYG2#的最适生长温度为32 ℃（图3）。

2.5.3菌株的最适生长pH。LYG2#的最适生长pH为8.5（图4）。

2.6菌株16S rRNA序列分析与构建系统进化树

LYG2#的16S rRNA基因序列全长为1 502 bp（GenBank：JQ087462）。

将测序得到的序列在NCBI中的Blast和EzTaxon server 2.1中分别进行比对，发现该菌株和最近的模式种Spiribacter salinus M19-40T的相似度最高，为95.98%，与其他模式种的相似度均在95.00%以下。分析系统发育学关系，获得进化树（图5）。

从进化树上看，LYG2#与Spiribacter salinus M19-40T单独聚类在一起，与其他的菌种不在一个分支上，可以断定菌株LYG2#属于Spiribacter属。而Spiribacter属目前只有这一个有效的命名种[9]。将菌株LYG2#与模式种Spiribacter salinus M19-40T进行了特征比较（表3）。结果表明，LYG2#与Spiribacter salinus M19-40T大多数的特征是相似的，却又在最适盐浓度、最适温度以及主要脂肪酸含量上有所不同，表现出一定的独特性。

3结论

从连云港青口卤水中分离纯化出一株嗜盐细菌LYG2#，并对该细菌进行了多项分类学鉴定。根据16S rRNA基因序列相似性、生理生化特性研究以及系统发育学分析，判断LYG2#为Spiribacter属的一个新种资源，命名为Spiribacter lygqingkouensis sp.nov.。该菌可以耐受很广的盐浓度范围，其生长对盐浓度有严格的依赖性，是一株中度嗜盐菌。自然界中嗜盐微生物具有極其丰富的多样性，新发现的嗜盐微生物的数量也越来越多，人们对这些微生物的研究也逐渐深入，嗜盐菌在工业、农业、生物技术领域的应用也会越来越广泛。

参考文献

[1] 沈萍.微生物学[M].北京：高等教育出版社，2000：23-324.

[2] 李云海，于德爽，张培玉.高盐度废水处理中优势耐盐菌鉴定与生长特性研究[J].青岛理工大学学报，2009，30（2）：59-64.

[3] 周培瑾.嗜盐细菌[J].微生物学通报，1989，16（1）：31-34.

[4] KUSHNER D J.Microbial life in extreme environments[M].London，United Kingdom：Academic Press，1978：317-368.

[5] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[6] LALITHA M K.Manual on antimicrobial susceptibility testing[M/OL].[2016-11-25].http：//www.docin.com/p-55484591.html.

[7] GERHARDT P，MURRAY R G E，WOOD W A，et al.Methods for general and molecular bacteriology[M].Washington，DC：American Society for Microbiology，1994.

[8] SAITOU N，NEI M.The neighborjoining method：A new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Mol Biol Evol，1987，4（4）：406-425.

[9] LEN M J，FERNNDEZ A B，GHAI R，et al.From metagenomics to pure culture：Isolation and characterization of the moderately halophilic bacterium Spiribacter salinus gen.nov.sp.nov.[J].Appl Environ Microbiol，2014，80（13）：3850-3857.