抗纤维化基因工程药物研究现状

韩瑞杰+王小花+张哲+李桂芹+刘海峰

[摘要]纤维化是导致器官功能慢性衰竭的主要原因，严重危害人类健康。目前临床上仍缺乏可有效逆转纤维化的药物。近年来，随着对纤维化发生机制认识的深入及分子生物技术的不断发展，基因工程药物在抗纤维化治疗中日益发挥重要作用。

[关键词]抗纤维化；基因生物工程药物；现状

[中图分类号] R453 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）12（b）-0018-04

Current situation of research on genetic engineering drugs

HAN Rui-jie1，2 WANG Xiao-hua3 ZHANG Zhe1 LI Gui-qin2 LIU Hai-feng1

1.Medical Research Center，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China；2.Hongqi Hospital Affliatied to Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China；3.College of Basic Medical of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

[Abstract]Fibrosis is the main cause of chronic organ failure，which is harmful to human beings.There still no effective drugs which can reverse fibrosis in clinic.Recently，with the research on pathogenesis of fibrosis and the development of molecular biological technology，genetic engineering drugs play an important role in anti-fibrosis therapy.

[Key words]Anti-fibrosis；Genetic engineering drugs；Gurrent situation

器官纖维化已成为当今危害人体健康的主要疾病之一，它是以细胞外基质过度沉积为特征的一种病理状态，涉及多种细胞因子、炎症介质和蛋白成分表达的改变，主要与细胞外基质的生成及降解失衡有关[1]。纤维化的持续进展可致器官结构破坏和功能衰竭，严重威胁人类生命健康。纤维化疾病可累及全身多个器官及系统，包括系统性硬化、移植物抗宿主硬皮病、特发性肺纤维化、肝硬化、进展性肾病、心血管纤维化等[2]。虽然目前抗纤维化的药物（细胞因子拮抗剂、胶原生物合成抑制剂和促进胶原分解的抗纤维化药物）取得良好的效果，但由于其制备周期长、造价昂贵等缺点而限制其临床应用。近年来，随着基因工程技术取得巨大进展，以蛋白质的结构与功能间关系为基础，通过周密的分子设计，进而利用基因工程技术来提高重组蛋白的活性，改善产品稳定性，提高生物利用度，延长其在体内的半衰期以及降低制品的免疫原性等优点把蛋白质改造成为合乎人类需要的蛋白质，已成为新药研发的新宠。基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源性DNA（目的基因）和载体DNA重组，最后将重组体转入宿主细胞，使外源性基因DNA在宿主细胞内随细胞的增殖而增殖。

1 Napsin A基因工程药物

Napsin A是一种近年发现的新的天门冬氨酸蛋白酶，主要表达于Ⅱ型肺泡和肾近端小管细胞中，被公认为是肺腺癌的标志物[3]。Napsin A基因含有5个外显子，其转录产物由1263 bp构成，A编码420个氨基酸的蛋白质。Napsin A相对分子量是35 kDa，等电点为5.29，其一级结构是由4部分构成，24个氨基酸残基组成的信号肽，40个氨基酸残基组成的前肽区，336个残基组成的功能区和18个残基组成的C末端[4]，但近年来研究表明其表达水平与肺纤维化密切相关。Samukawa等[5]研究表明，在肺纤维化的患者血清中Napsin A明显增加，提示管血清中Napsin A可作为临床诊断肺纤维化的标志物。Zheng等[6]采用转移质粒、辅助质粒和包膜表达质粒三个部分构建的慢病毒系统PLJM1-Napsin A，将其转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞A549的肺纤维化模型中，结果发现，转染Napsin A基因的Ⅱ型肺泡上皮细胞A549在上皮-间质转化过程中的增殖能力明显受到抑制，同时，上皮细胞的标志物E-cadherin表达水平下降而间充质细胞的标志物Fibronectin表达增加，可见Napsin A基因工程制品可以有效治疗肺纤维化。

2 细胞球蛋白基因工程药物

细胞球蛋白（Cytoglobin）属于肝星状细胞激活相关蛋白，表达于各种组织的成纤维细胞中。Stone等[7]研究表明，细胞外基质蛋白通过依赖于FAK信号通路来调控Cytoglobin的表达，进而影响纤维化的发生发展；进一步研究表明Cytoglobin能够负向调控肝星状细胞的活化。Mimura等[8]研究表明，过表达Cytoglobin能改善组织的病理变化，保留肾功能和延缓纤维化的发生；同时表明Cytoglobin的这种保护作用与硝基酪氨酸的沉积和尿中羟基脱氧鸟苷的排泄密切相关。He等[9]使用基因工程的方法制备Cytoglobin，研究发现，与对照组比较，在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化SD大鼠模型中，Cytoglobin处理的SD大鼠纤维化程度明显减轻，主要表现在反映肝纤维化等级的重要指标（血浆天冬氨酸氨基转移酶、透明质酸、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及肝脏羟脯氨酸）的含量均明显降低；同时抑制大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖和促进其凋亡；进一步研究表明，Cytoglobin抑制B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和促进Bax蛋白表达，进而增加了Bax/Bcl-2的比例，提示Cytoglobin通过诱导细胞凋亡途径来在体内外实验中达到抗肝纤维化的目的，可见Cytoglobin基因工程药物代表一种新颖的抗纤维化药物。

3 肝细胞生长因子基因工程药物

肝细胞生长因子（HGF）是酪氨酸激酶表面配体受体（c-Met）的有效激动剂，它与分散因子为同一分子，是重要的抗纤维化因子[10]，可介导细胞的生长、存活和运动，对组织的再生发挥有重要作用，但其自身结构复杂，利用哺乳动物表达系统生产重组蛋白的翻译后修饰也很复杂，故哺乳动物细胞培养法制取重组人肝细胞生长因子（rhHGF）产量受到限制并且成本昂贵。Sonnenberg等[11]使用組合蛋白工程法，利用酵母菌系统大量生产出HGF工程片段（HGF-f）作为rhHGF的替代物，这种激动剂二聚体在体外实验显示出与rhHGF类似的功能。研究发现，与对照组比较，过表达HGF-f的心脏细胞中上调基质金属蛋白酶（MMP）-1及MMP-9的mRNA表达，同时下调转化生产因子-β1（TGF-β1）的表达。MMP-1和MMP-9在多种组织中能降解细胞外基质来减轻纤维化，而TGF-β1在超过15种组织中能诱导细胞外基质的表达来增加纤维化，提示HGF对纤维化疾病具有治疗作用。重组蛋白HGF自身不稳定，能迅速被广泛表达在肝细胞表面和细胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）螯合，这种天然分子同样趋向于聚合。这些特征限制了活化的生长因子的数量，同时也限制了其在临床上的应用。HGF包含2条多肽链和6个结构域：N端结构域（N）、4个具有α重链的环状结构域（K1～K4）和一个具有β轻链的丝氨酸蛋白酶同源结构域，HGF对HSPG有两个结合位点：高亲和力的在N结构域、低亲和力的在K1结构域。NK1是HGF自然生成的剪接变体，编码N结构域和K1结构域，Ross等[12]通过蛋白质工程手段生成了NK1的突变体1 K1（K132E∶R134E），它的K1结构域HSPG低亲和力结合位点通过Lys132和Arg134的反相电荷突变被破坏掉，这改变了K1表面的静息电位。研究显示1 K1工程蛋白和天然HGF蛋白具有相似的促人初级肝细胞增生和抗凋亡的功能，并且1 K1具有更好的溶液稳定性，在Balb/c小鼠4周的CCl4诱导肝纤维化期间内给予1 K1直至小鼠被处死，天狼星红染色切片的结果表明，与对照组比较，1 K1组肝纤维化明显减少了19%，ALT水平减少了30%。以上研究表明，肝细胞生长因子工程药物具有抗纤维化的功能。

4转化生长因子Ⅱ型受体TβRⅡ基因工程药物

转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，在纤维化的发生发展中发挥关键的作用，被公认为是迄今发现的最强的诱导肝星状细胞增殖、活化、迁移和细胞外基质（ECM）沉积的促进剂，其中TGF-β1在纤维化中起主要作用[13]。TGF-β1参与细胞的生长分化，组织器官的胚胎发育，损伤后修复等多种生物学效应，特别是对ECM的沉积和抑制MMPs起着重要的作用[14-15]。TGF-β的生物学功能是通过与其细胞膜上的受体相结合来实现的。TGF-β有2个主要的细胞膜受体：TGF-β Ⅰ型受体（TβRⅠ）和TGF-β Ⅱ型受体（TβRⅡ）均为穿膜的丝氨酸/苏氨酸激酶，是信号传导所必需的，两者结构类似，均包括膜外区域、单跨膜区域、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和胞质区域。其中TβRⅡ可单独与TGF-β结合，而TβRⅠ必须在TβRⅡ与TGF-β结合的条件下才能与TGF-β结合[16]，因此，TGF-β的生物学功能取决于TGF-β的活化和TβRⅡ的存在[17]。阻断TGF-β信号传导通路，便可有效的抑制过表达的TGF-β所引发的纤维化。Liu等[18]应用腺病毒载体转染介导游离型全长TβRⅡ基因至靶细胞，其与野生型的TβRⅡ竞争结合TGF-β1，导致部分野生型受体无法结合到TGF-β1而达到抑制TGF-β1功能的目的。Chu等[19]研究表明，通过筛选截短型的TβRⅡ，能与野生型的TβRⅡ竞争结合纤维化过程中产生的TGF-β1，进一步抑制纤维化细胞的增殖和细胞外基质蛋白的表达。Liu等[20]研究表明，通过基因克隆手段扩增截短型的TβRⅡ，通过原核表达制备截短型TβRⅡ，作用于纤维化的细胞中，不但抑制纤维化细胞的增殖，而且抑制纤维化相关的胶原蛋白的表达。郁子扬等[21]构建了稳定表达大鼠sTβRⅡ-IFNγ（sTβRⅡ-IFNγ）融合蛋白的真核表达系统，采用pSecTag2/TβRⅡ-IFNγ真核表达质粒直接肌肉注射法基因治疗，其明显减少二甲基亚硝胺（DMN）诱导的大鼠HSC活化，减少α-SMA和ECM表达，减轻肝纤维化程度，且其效果较单独sTβRⅡ或IFNγ表达质粒更明显。以上研究表明，截短型的TβRⅡ是一种更为安全、稳定和有效地治疗纤维化的蛋白药物。

5 角质细胞生长因子基因工程药物

角质化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）是成纤维细胞生长因子（FGF）家族中的第七个成员，它介导多种组织中表（上）皮细胞增殖和分化来调控肺上细胞的损伤[22]。Yao等[23]研究表明，KGF通过调控音猥因子（SHH）信号通路来激活干细胞的分化，进而达到保护低氧诱导的肺纤维化。Sakamoto等[24]研究表明，腺病毒过表达KGF可降低博来霉素诱导的纤维化的小鼠的致死率，说明KGF能达到抑制纤维化发生。于程程等[25]研制出中性粒细胞抑制因子（neutrophil inhibitory factor，NIF）-KGF双重功能的基因嵌合体，随后的小鼠实验表明该嵌合体蛋白能明显抑制急性肺损伤后循环内白细胞的增加和博来霉素诱导的肺炎及肺纤维化，提示其可用于治疗肺纤维化和其它涉及白细胞活化浸润及组织纤维化的多种临床疾病。

综上所述，工程药物具有活性高、毒性低、特异性强、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠，故已成为医药产品中的重要组成部分。但蛋白质相对分子量大、对蛋白分解酶敏感及在生物体内血浆清除快、口服绝对生物利用度低，因此大多数治疗性蛋白药物由静脉、肌内和皮下注射，其给药途径受限。同时，由于该类药物为外源性蛋白，其物理化学性质与小分子药物不同，药动学和药效学研究面临许多困难，而且稳定性不高、在体内半衰期短、需频繁给药、生物利用率低等缺点，在生理和心理上对患者造成极大的负担。未来应进一步完善工程药物的药动学和药效学研究及药物的长效性的研究，以获得理想的治疗效果。另外，对于其安全性及伦理性方面的问题也存在争议，这些问题能否妥善解决都将影响整个产业的发展前景。

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