动物免疫抗体产生因素的初步研究

魏 力，徐宁迎

(浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058)

动物免疫抗体产生因素的初步研究

魏 力，徐宁迎

(浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058)

动物的免疫保护效果受抗原剂量、浓度、佐剂、接种间隔时间以及抗体检测方法等多种因素的影响。为确定试验兔免疫过程中影响免疫效果的具体因素及其影响程度，优化兔子的免疫程序，笔者探究了佐剂、免疫次数和性别对供试兔免疫保护效果的影响。结果显示：佐剂组新西兰大白兔抗体水平显著高于对照组(P<0.01)；不同性别组新西兰大白兔的抗体滴度水平均随免疫次数呈上升趋势，组间上升趋势相近(P>0.05)；同时，在一定范围内，抗原活化B细胞产生的抗体水平与免疫次数呈正相关，但到达一定限度后抗体水平不再显著上升。

抗原；免疫程序；抗体水平；佐剂；兔

免疫程序是根据动物年龄、疫苗种类、饲养目的等制定的免疫接种计划，包括接种时间、接种剂量、接种途径、接种次数等。免疫程序的选择需多方面、综合性考量，其结果可能受抗原、佐剂、接种间隔时间等多种因素影响。对于同种疫苗，不同的免疫程序对其免疫效果影响较大[1]。明确免疫程序中具体影响因素的作用，通过改进、优化免疫程序，对于收获高效的免疫保护效果具有重要意义。

影响动物免疫保护效果的因素一般有疫苗质量、疫苗剂量、佐剂、免疫时间和次数等。佐剂与抗原同时或预先应用，能增强机体针对该抗原的免疫应答能力，对于提升抗原或疫苗的免疫保护效果起着重要作用[2]。首免时间和次数对于免疫保护效果的影响同样较大[3]。此外，动物如果存在先天性免疫缺陷，或者感染某些可引起免疫抑制的病原(如PRRSV、IBDV等)，其免疫系统受损，也会最终影响免疫保护效果。

近年来，浙江、四川等地养兔产业蓬勃发展，部分养殖户对于优化家兔免疫程序具有现实需求，同时关于家兔免疫保护效果影响因素的研究报道相对较少，本研究旨在探讨抗原、佐剂、免疫次数和性别对家兔免疫效果的影响，以期为制定科学的免疫程序提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验兔购自杭州某兔业专业合作社，随机选择3月龄新西兰大白兔60只(公母各30只)，体重2.5～2.6 kg。随机分成6组，每组5只公兔、5只母兔，分别命名为PKC zeta+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2、PKC zeta、P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2、P300组(详见表1)。

表1 试验动物分组

1.2 抗原与佐剂 试验选用PKC zeta与P300两种抗原；FCA/FIA、Montanide ISA50 V2作为疫苗佐剂。其中FCA/FIA购自美国Sigma公司，Montanide ISA50 V2购自法国SEPPIC公司。

1.3 试验方法 试验期71 d，初免时间为第4 d，然后于第25 d、39 d、53 d和67 d进行第二至第五次的加强免疫，所有供试兔均于71 d时剖杀，采集血样和脾脏，并于每次免疫前3 d采集血样备用。每次免疫佐剂量为0.5 mL ，抗原量除第一次和第五次为0.5 mg外，其余均为0.25 mg，浓度为1 mg/mL。采用皮下分点注射免疫。

血清抗体水平检测按ELISA试剂盒说明步骤检测血清抗体水平，每份血清检测3次。

2 结果与分析

2.1 佐剂和抗原对特异性IgG抗体水平的影响 详见图1、图2。

图1 血清中抗PKC zeta特异性IgG抗体的动态变化

由图1可见，从二免开始至终免，PKC zeta+FCA/FIA组与PKC zeta+Montanide ISA50 V2组的抗体水平一直高于PKC zeta组，差异极显著(P<0.01)，提示疫苗佐剂FCA/FIA与Montanide ISA50 V2均具有良好的免疫增强效果，且对PKC zeta抗原而言，佐剂FCA/FIA的免疫增强效果优于佐剂Montanide ISA50 V2。

图2 血清中抗P300特异性IgG抗体的动态变化

由图2可见，从二免开始至终免，除二免时P300与P300+FCA/FIA组抗体水平无显著差异外(P>0.05)，其余各时期P300+FCA/FIA组与P300+Montanide ISA50 V2组抗体水平差异均显著高于对照组P300组(P<0.05)，其中三免时P300+Montanide ISA50 V2组与P300组抗体水平差异极显著(P<0.01)。结果提示佐剂FCA/FIA与Montanide ISA50 V2均具有较好的增强免疫应答效果，且对P300抗原，Montanide ISA50 V2佐剂的增强效果优于FCA/FIA佐剂。

2.2 动物性别对特异性IgG抗体水平的影响 详见图3。

由图3可见，免疫抗原PKC zeta、PKC zeta+佐剂FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2免疫后，公、母兔抗体水平均呈上升趋势，且两种趋势相近，差异不显著(P>0.05)。免疫抗原P300免疫后，公、母兔抗体水平基本维持不变，两者无显著差异(P>0.05)；免疫P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2后，公、母兔抗体滴度水平均呈上升趋势，两者趋势相近，差异不显著(P>0.05)。

2.3 免疫次数对特异性IgG抗体水平的影响 详见图4。

由图4可见，采用PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2、P300、P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2 6组抗原+佐剂免疫后，除抗原P300组的一免外，其他各组的抗体水平总体随免疫次数呈上升趋势，其中PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、P300+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2组的抗体水平上升趋势呈线性上升，而P300+Montanide ISA50 V2组抗体水平则在三免前抗体水平呈线性上升，之后一直维持在较高水平。由此可见，随着免疫次数的增加，动物抗体水平呈现上升趋势，至一定限度后上升幅度渐趋平缓；提示在一定范围内，抗原活化B细胞产生的抗体水平与免疫次数呈正相关，到达一定限度后，不再上升而是维持在较高水平；研究结果与克隆选择理论基本一致。

3 小结与讨论

抗原免疫保护效果受抗原剂量与浓度、佐剂、免疫接种间隔时间及抗体检测方法等多种因素影响[4]。因此，明确每一种因素的影响效果，对合理优化抗原的免疫程序具有重要意义。笔者在本次试验中着重探讨了抗原、佐剂、免疫次数和动物性别对免疫保护效果的影响，以期为制定科学的免疫程序、进一步提高疫苗的免疫保护效果提供试验依据。

图3 不同性别新西兰大白兔免疫PKC zeta、P300后特异性IgG抗体的动态变化

3.1 佐剂对于免疫保护效果具有重要影响 由图1与图2可知，抗原组的抗体水平显著低于抗原+佐剂组的抗体水平，显示了佐剂具有良好的免疫增强效果。使用佐剂FCA/FIA、Montanide ISA50 V2均能诱导强而持久的免疫保护效果，且两者各具优势，FCA/FIA作为经典的油包水佐剂，来源广泛、价格经济；而Montanide ISA50 V2乳剂非常稳定、易于注射且基本无副作用[5]。

3.2 动物性别对于免疫保护效果的影响不显著 由图3可知，同一抗原不同性别组的抗体水平之间无显著性差异，显示动物性别对免疫保护效果无明显影响或影响不显著。理论上认为，动物的免疫保护效果受抗原本身、佐剂、免疫程序、机体健康水平等多种因素的影响，性别因素则对其影响甚微，目前亦未见相关报道证实动物性别因素在免疫保护效果方面存在显著影响。

3.3 免疫次数与免疫效果存在相关性 由图3、图4可知，在一定范围内抗体水平与免疫次数呈正相关，达到一定限度后，抗体水平不再显著上升而维持在较高水平。

图4 不同免疫次数的新西兰大白兔特异性IgG抗体的动态变化

鉴于动物性别对于抗原免疫保护效果的影响不显著，故将同一抗原免疫的10只供试兔的相关数据合并统计，即每一组10只供试兔不再区分公母，一并统计。从图4可知，随着免疫次数的增加，试验动物抗体水平亦不断升高，如PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、P300+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2组；比较特别的是，P300+Montanide ISA50 V2组抗体水平先随免疫次数增加而增加，后维持较高水平不再上升。试验结果表明：抗体水平达到一定限度后，抗体水平不再随免疫次数增加而上升，而是维持在较高水平或趋缓慢上升，这与顾一峰等(2004)[6]对大鼠的相关研究结果相似。因此，为获得较高的抗体水平不可一味加大免疫剂量，达一定限度后即使增加免疫剂量抗体水平也不再上升，有时还会加重动物的承载负担，故应根据抗体监测水平决定免疫次数，适量免疫。推荐采用低剂量长程免疫的免疫方法为佳。

根据上述佐剂、性别、免疫次数对抗原免疫保护效果影响的试验与分析，可以确定家兔免疫程序中佐剂、免疫次数和动物性别的作用，而且可从该角度出发经科学安排以提高抗原免疫保护效果。为获得良好的免疫保护效果，建议可选择适宜的免疫程序和佐剂、适当增加免疫次数来提高动物的免疫保护效果。

[1]陈果亮.规模化猪场猪瘟疫苗群体免疫程序的研究[D].长沙:湖南农业大学, 2013:69-70.

[2]Takahashi H，Takeshita T，Morein B,etal.Induction of CD8+ cytotoxic T cells by immunization with purified HIV-1 envelope protein in ISCOMs[J].Nature,1990,344:873-875.

[3]薛家宾,杨龙圣,徐为中，等.免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响[J].江苏农业科学,2006,6:327-329.

[4]Johnston BA,Eisen H,Fry D.An evaluation of several adjuvant emulsion regimens for the production of polyclonal antisera in rabbits[J].Lab Anim Sci,1991,41:15-21.

[5]刘卫涛,柳 洲,李育合，等.新佐剂Montanide ISA 50V2在马免疫中的应用研究[J].微生物学免疫学进展,2013,41(4):42-44.

[6]顾一峰,张新民,马宇滢，等.不同免疫次数对大鼠血清总IgE和特异性IgE的影响[J].上海实验动物科学,2004,24(4): 234-239.

2017-02-20

S852.4

A

1005-7307(2017)03-0006-004