血清中期因子、血小板因子4和黏蛋白1含量检测对乳腺癌患者病情评估的价值

郭志峰

[摘要] 目的 探討血清中期因子（MK）、血小板因子4（PF4）及黏蛋白1（MUC1）的含量检测在乳腺癌患者病情评估中的应用价值。 方法 选取2012年10月～2016年2月内蒙古自治区赤峰市医院（以下简称“我院”）肿瘤内科收治的180例乳腺肿瘤患者作为观察对象，依据组织病理分型将其分为乳腺良性肿瘤（90例）、乳腺癌（90例）。其中90例乳腺癌患者依据TNM分期分为Ⅰ/Ⅱ期（40例）、Ⅲ/Ⅳ期（50例）；根据分化程度分为高/中分化（50例）、低/未分化（40例）；根据淋巴结转移情况分为淋巴结未转移（50例）、淋巴结转移（40例）。将同期在我院接受体检的120名健康女性作为对照组。收集血清，比较各组之间血清MK、PF4以及MUC1的含量。实时荧光定量PCR（qPCR）检测乳腺癌细胞内MK、PF4以及MUC1过表达对基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP9表达的影响，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测过表达MK、PF4以及MUC1对细胞上清中血管内皮生长因子（VEGF）A、VEGFB和VEGFC含量的影响。 结果 乳腺良性肿瘤患者MK和PF4含量明显高于对照组（P < 0.05），乳腺癌患者血清中MK、PF4及MUC1的含量明显高于乳腺良性肿瘤患者（P < 0.05）；Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴结转移患者血清中MK、PF4以及MUC1含量明显高于Ⅰ/Ⅱ期、高/中分化、淋巴结未转移的患者（P < 0.05）；过表达MK、PF4以及MUC1组细胞内MMP2和MMP9的mRNA含量明显高于空载体对照组（P < 0.05）；过表达MK、PF4以及MUC1组细胞培养上清中VEGFA、VEGFB、VEGFC的含量明显高于空载体对照组（P < 0.05）。 结论 乳腺癌患者血清中MK、PF4以及MUC1异常升高；MK、MUC1过表达可能通过调节MMP2、MMP9以及VEGFA、VEGFB、VEGFC的表达影响血管新生和乳腺癌的侵袭。MK、PF4和MUC1可作为新的判定乳腺癌生物学行为的血清标志物。

[关键词] 乳腺癌；中期因子；血小板因子；黏蛋白；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（b）-0099-04

[Abstract] Objective To investigate the application value of content determination of serum midkine （MK）， platelet factor 4 （PF4） and mucoprotein 1 （MUC1） in the disease assessment of patients with breast cancer. Methods One hundred and eighty patients with breast cancer admitted to Department of Medical Oncology， Chifeng Hospital （“our hospital” for short） from October 2012 to February 2016 were selected as research objects， and they were divided into benign breast tumor （90 cases） and breast cancer （90 cases）. The 90 cases with breast cancer were divided into Ⅰ/Ⅱ stage （40 cases） and Ⅲ/Ⅳ stage （50 cases） according to the TNM staging； they were divided into high/medium differentiation （50 cases） and low/undifferentiated （40 cases） dependent on differentiation grade； they were divided into without lymphatic metastasis （50 cases）， lymphatic metastasis （40 cases） according the conditions of lymphatic metastasis. Meanwhile， 120 cases of healthy women taken physical examination in our hospital at the same time were recruited as control group. The serum was collected， and the contents of MK， PF4 and MUC1 in all groups were compared. The effects of over-expression of MK， PF4 and MUC1 in the breast cancer cells for the expression of matrix metalloproteinase （MMP）2 and MMP9 were detected by real-time quantitative PCR （qPCR）. The effects of over-expression of MK， PF4 and MUC1 for the contents of vascular endothelial growth factor （VEGF）A， VEGFB and VEGFC in cellular supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The contents of serum MK and PF4 in patients with benign breast tumor were significantly higher than those of control group （P < 0.05）. While， the contents of serum MK， PF4 and MUC1 in patients with breast cancer were significantly higher than those of patients with benign breast tumor （P < 0.05）. The contents of serum MK， PF4 and MUC1 in patients with Ⅲ/Ⅳ stage， low/undifferentiated and lymphatic metastasi were significantly higher than those of patients with Ⅰ/Ⅱ stage， high/medium differentiation and without lymphatic metastasis （P < 0.05）. The contents of mRNA of MMP2 and MMP9 in the cells with over-expression of MK， PF4 and MUC1 were significantly higher than that of empty gsensor control group （P < 0.05）. Moreover， the contents of VEGFA， VEGFB and VEGFC in supernatant of cells with over-expression of MK， PF4 and MUC1 were significantly higher than that of empty gsensor control group （P < 0.05）. Conclusion The contents of serum MK， PF4 and MUC1 in patients with breast cancer were absolutely increased. Over-expression of MK and PF4 affects angiogenesis and the invasion of breast cancer may be through regulating the expression of MMP2， MMP9 and VEGFA， VEGFB， VEGFC. MK， PF4 and MUC1 can be as the new serum markers to judge the biological behavior of breast cancer.

[Key words] Breast cancer； Midkine； Platelet factor； Mucoprotein； Matrix metalloproteinase； Vascular endothelial growth factor

乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤[1]，其诊疗的关键是早期诊断，目前，常通过检测肿瘤组织中的相关分子进行病理分期和肿瘤恶性程度的判定[2]。肿瘤组织的获取需要穿刺活检，属于有创检查的范畴，不适合病情的长期监测和评估[3]；并且，一般影像学能查出时肿瘤灶已较大，穿刺活检在发现早期肿瘤并进行诊断方面存在弊端，迫切需要新的临床诊断标志物。中期因子（MK）在不同肿瘤中呈明显高表达，且与肿瘤发生、发展、血管形成及转移密切相关，严重影响预后[4]。血小板因子4（PF4）通过促进血小板的产生调节肿瘤微环境进而加剧肿瘤生长[5]。Solassol等[6]在2010年首次报道，PF4在乳腺导管原位癌中的表达明显高于非癌变组。PF4在其他的肿瘤早期也呈高表达，已成为结、直肠癌病变的独立预测因子[7-8]。黏蛋白1（MUC1）作为黏蛋白家族成员，在乳腺癌细胞中也呈现高表达[9]，在乳腺癌诊断和治疗中具有潜在的临床应用价值。本研究探讨了MK、PF4和MUC1在正常乳腺、乳腺良性肿瘤及乳腺癌人群血清中的表达情况，通过体外细胞实验深入探究了MK、PF4和MUC1在乳腺癌进展中可能的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年10月～2016年2月在内蒙古自治区赤峰市医院（以下简称“我院”）治疗的乳腺肿瘤患者180例，均经病理确诊为乳腺肿瘤，且未接受化疗、放疗及内分泌治疗，无既往肿瘤病史，年龄31～70岁，中位年龄55岁，按组织病理学分为乳腺良性肿瘤（90例）、乳腺癌（90例）。按照UICC/AJCC 2009年第7版TNM分期标准[1]将90例乳腺癌患者分为Ⅰ/Ⅱ期（40例）、Ⅲ/Ⅳ期（50例）；根据分化程度分为高/中分化（50例）、低/未分化（40例）；根据淋巴结转移情况分为未转移（50例）、转移（40例）。选取同期在我院接受体检的120名健康女性作为对照组，年龄30～66岁，中位年龄53岁。所有患者均术前取静脉血2 mL，取血浆置于-80℃保存待测。

1.2 主要试剂

MK（货号ESK5522-96T）购自上海生工有限公司，PF4（Fitzgerald产品，货号：55R-1999）为北京达科为生物技术有限公司，MUC1定量酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号：E0413h）购自北京华夏远洋科技有限公司，血管内皮生长因子（VEGF）A、VEGFB和VEGFC的产品均为Abnova产品，购于艾美捷科技有限公司。RPMI1640、TRIzol购自Gibco，逆转录酶（M-MLV）、RNA酶抑制剂、dNTP、Taq DNA聚合酶、琼脂糖等均购于Promega公司。Lipofect2000购于Invitrogen。pcDNA4-MK、pcDNA4-PF4、pcDNA4-MUC1质粒为我院外科实验室质粒库保存的质粒。

1.3 实验方法

1.3.1 酶聯免疫吸附测定 采用全自动酶标仪VERSAmax（美国），按照ELISA试剂盒说明书加入不同浓度的标准品100 μL，待测样品100 μL，100 μL的蒸馏水为空白对照。每孔加50 μL的酶标记溶液。封口胶密封酶标板，37℃孵育箱中孵育反应1 h。酶标板清洗5次。最后，用吸水纸彻底拍干。每孔各加入50 μL A、B显色液。避光，20～25℃反应15 min，加入50 μL终止液终止。在450 nm波长下进行吸光度的测定，依据标准品读数，绘制标准曲线。将待测样品数据代入标准方程，计算得出结果。

1.3.2 细胞转染 实验分四组，分别转染5 μg空载体、5 μg pcDNA4-MK、5 μg pcDNA4-PF4、5 μg pcDNA4-MUC1。按照Lipfectamine2000说明书，转染MCF-7细胞24 h，收集细胞培养上清，ELISA检测VEGFA、VEGFB、VEGFC的表达。实时荧光定量PCR（qPCR）检测MMP2和MMP9的表达。

1.4 实时荧光定量PCR

Trizol试剂盒提取细胞样本总RNA，将总RNA通过MMLV逆转录成cDNA。qPCR检测MK、PF4及MUC1的过表达效率及MMP2和MMP9的表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对相关数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK、PF4和MUC1在乳腺癌患者血清中显著高表达

乳腺良性肿瘤患者中MK、PF4的含量较对照组显著增高（P < 0.05），而MUC1在对照组和乳腺良性肿瘤患者中的表达变化差异无统计学意义（P > 0.05）。与乳腺良性肿瘤患者比较，乳腺癌患者MK、PF4和MUC1均显著上调（P < 0.05）。见表1。与淋巴结未转移、Ⅰ/Ⅱ期、高/中分化患者比较，淋巴结转移、Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化患者中MK、PF4和MUC1的表达明显上调（P < 0.05）。见表2～4。

2.2 过表达MK、PF4和MUC1促进VEGFA、VEGFB、VEGFC的表达

过表达MK和MUC1后，VEGFA、VEGFB、VEGFC的表达明显上调（P < 0.01），而过表达PF4显著抑制了VEGFA、VEGFB和VEGFC的表达（P < 0.05）。见表5。

2.3 过表达MK、PF4和MUC1促进MMP2和MMP9的表达

过表达MK、PF4和MUC1，qPCR检测MMP2和MMP9的表达，MK、PF4和MUC1显著促进了MMP2和MMP9的表达（P < 0.01）。见图2。

3 討论

研究发现MK与肿瘤血管形成有关[10]。过去MK的研究多侧重于检测肿瘤组织中MK的表达，忽略了血清学的检测[11]。本研究发现MK在乳腺癌患者血清中的表达水平明显高于健康人和乳腺良性肿瘤患者，并且过表达MK促进VEGFA、VEGFB、VEGFC的表达和MMP2、MMP9的表达，其中VEGF与血管的形成有关，而MMP2和MMP9可能通过改变细胞的黏附参与肿瘤细胞的侵袭和迁移过程。由此推断：MK参与乳腺肿瘤的进展可能通过促进VEGFs和MMPs的表达参与血管形成和癌细胞迁移。

PF4是内源性血管生成抑制物，抑制VEGF功能而发挥作用。本研究也印证PF4抑制VEGF的表达，本研究发现，PF4在乳腺癌患者血清中呈明显高表达趋势。有研究认为PF4通过促进血小板的形成，参与肿瘤的发生发展[7]。本研究的不足之处是未深入研究PF4对乳腺癌形成的影响机制。在今后的研究中，还将进一步深入探讨PF4在乳腺癌进展中的功能机制。

MUC1为膜结合型黏液素分子，加速肿瘤的生长和转移[12]。在乳腺癌中常出现顶端定位不清，呈非极性分布且过度表达[13]。MUC1的抗原决定簇CA15-3通常作为血清癌胚抗原，用于监测乳腺癌的复发转移，在出现远处转移的乳腺癌患者中，有50%～80%的患者伴有CA15-3水平增高[14]。MUC1在乳腺癌组织中的阳性表达率较高（78%～90%）[15]。由于其在肿瘤组织尤其是在腺癌患者组织和血清中有较高的表达，使其成为一种新的肿瘤标志物。目前，临床上已有检测外周血MUC1表达的试剂盒，对于晚期和复发转移患者的检出率可达75%，但对于早期的乳腺癌患者检出率较低[16]。本研究也发现，在正常健康人和乳腺良性疾病患者的血清中，MUC1表达量变化不明显。因此推测：MUC1并非是乳腺癌早期诊断的理想标志物，MUC1可能在乳腺癌的动态追踪、疗效判定和预后诊断方面有一定的参考价值。

综上所述，MK、PF4和MUC1在乳腺癌患者血清中显著增高，并且与乳腺癌分期进展及淋巴结转移密切相关，越晚期的乳腺癌患者，血清中MK、PF4和MUC1的含量越高，并且，乳腺良性肿瘤MUC1表达相比正常人变化不明显，提示MUC1作为早期的预警标志物不理想。进一步的细胞实验显示：过表达MK和MUC1显著促进VEGFA、VEGFB和VEGFC表达以及MMP2和MMP9的表达，提示，MK和MUC1可能参与乳腺癌组织中血管的形成，并且可能与乳腺癌的侵袭有关。总之，本研究提示，血清中MK和PF4可能作为早期的预警标志物，而MUC1可能参与乳腺癌的进展与侵袭。

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（收稿日期：2016-11-17 本文編辑：张瑜杰）