垃圾渗滤液中好氧反硝化菌的筛选及其反硝化条件优化

易 立, 黄少斌*, 潘梦岚

(1.华南理工大学 环境与能源学院，广东 广州 510006；2.污染控制与生态修复广东省普通高等学校重点实验室，广东 广州 510006)

垃圾渗滤液中好氧反硝化菌的筛选及其反硝化条件优化

易 立1,2, 黄少斌1,2*, 潘梦岚1,2

(1.华南理工大学 环境与能源学院，广东 广州 510006；2.污染控制与生态修复广东省普通高等学校重点实验室，广东 广州 510006)

从江苏省常州市某垃圾渗滤液处理厂的纯氧曝气池中提取活性污泥，筛选获得1株高效好氧反硝化菌CZ1。根据菌株形态、生理生化特性进行初步鉴定，并结合该菌株的16S rDNA基因序列分析，判定该菌株为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。研究了菌株的好氧反硝化特性，结果表明，以硝酸钾为唯一氮源，CZ1在24 h内对硝酸盐氮的去除率达到97.69%。同时考察了碳源种类、C/N、温度、初始pH以及溶解氧对该菌株好氧反硝化能力的影响，通过单因素实验获得其最佳好氧反硝化条件：温度35 ℃，丁二酸钠为唯一碳源，C/N为6，初始pH值为7.0～7.5，转速为160 r/min。

垃圾渗滤液;菌株分离鉴定;蜡样芽胞杆菌;反硝化条件

垃圾填埋后自身含有的水分在雨雪水等的混合下，经过微生物降解产生的高浓度有机废水叫做垃圾渗滤液[1]，其中污染物种类多且复杂，包含数十种有机污染物及各种金属离子。而且由于其水量变化大，导致水质也有较大变化。同时它还具备氨氮浓度高、可生化性差等特性[2]。因此，如何有效合理地处理垃圾渗滤液是一项非常有意义的课题[3]。生物脱氮技术由于具有成本低、操作简单以及其独有对环境不造成二次污染的优势，广受人们青睐。随着近年来国内外研究学者的不断探索，生物脱氮技术理论获得新的突破。1988年Robertson等[4]首先分离出可以在有氧环境中生长并进行反硝化作用的细菌，推翻了反硝化菌只能在厌氧条件下生存的传统认知。自此好氧反硝化受到国内外学者的特别关注，并对其进行了普遍深入的研究。国内外学者在研究过程中，陆续从污泥、废水、土壤、海水和垃圾渗滤液中分离出了多种好氧反硝化菌，其中以芽胞杆菌属(Bacillussp.)[5]、副球菌属(Paracoccussp.)[6]、假单胞菌属(Pseudomonassp.)[7]、产碱杆菌属(Alcaligenessp.)[8]等种属的菌种居多。好氧反硝化菌具有环境适应性强、生长速度快的优点，且多数还具有异养硝化的能力，即硝化和反硝化能同时同一空间进行[9]，既简化工艺流程，又节约用地面积，减少了基建投资费用。因此，筛选高效好氧反硝化菌用于垃圾渗滤液的处理具有重大的现实意义。本研究从江苏省常州市某垃圾渗滤液处理厂纯氧曝气池的活性污泥中，筛选得到1株高效的好氧反硝化菌,对其形态及生理生化特征和16S rDNA进行鉴定，并在实验室条件下对其进行了反硝化特性的研究，为垃圾渗滤液的生物处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 江苏省常州市某垃圾渗滤液处理厂的纯氧曝气池中的活性污泥。

1.1.2 培养基(g/L) ①溴百里酚蓝培养基(BTB)：KNO31.0，丁二酸钠10，Na2HPO41.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.15，琼脂20.0，微量元素2 mL/L，BTB(0.1 g溴百里酚蓝溶于10 mL乙醇)1 mL/L，pH 7.0～7.5；②种子培养基(FM)：营养肉汤 15，pH 7.0～7.5；③反硝化培养基(DM)：KNO31.0，丁二酸钠10，Na2HPO41.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.15，微量元素2 mL/L，pH 7.0～7.5，各物质根据具体实验要求进行调整；④微量元素溶液成分：(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1，CuSO4·5H2O 1.57，MnCl2·4H2O 5.06，CaCl25.5，FeSO4·7H2O 5.0， CoCl·6H2O 1.61，ZnSO42.2，乙二胺四乙酸二钠50.0。所有的培养基均经121 ℃灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离与筛选 将从纯氧曝气池中取得的活性污泥制成污泥悬液，于无菌操作台取5 mL污泥悬液置于95 mL已灭菌的DM培养基中，40 ℃、160 r/min恒温振荡培养。培养24 h后，从中取5 mL菌液置于新的95 mL已灭菌的DM培养基中，重复此过程3次后，取菌液测定硝酸盐去除率，结果表明去除率超过80%。然后取0.1 mL菌悬液置于0.9 mL无菌蒸馏水中，得到10-1梯度菌悬液，反复此操作后获得10-2～10-8梯度的菌悬液。然后取各梯度菌液0.1 mL涂布于BTB固体培养基，每个梯度3个平行。最后把平板倒置于40 ℃恒温恒湿培养箱中培养2 d，其后培养基出现带有蓝色光圈的单菌落。用接种环挑取BTB平板中形态不同的单菌落在DM固体培养基上划线，分离纯化3次，测定脱氮效率，得到1株脱氮效率超过90%的目的菌株。

1.2.2 菌株形态及生理生化鉴定 对照《常见细菌系统鉴定手册》[10]及《伯杰细菌鉴定手册》[11](第8版)内容对菌株进行鉴定。

1.2.3 16S rDNA基因序列测定 提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增，以F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和R1492(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)作为引物扩增细菌的16S rDNA。扩增后以1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。PCR扩增采用20 μL反应体系，过程如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸7 min。测定工作由广东省微生物分析检测中心完成，通过Blast软件对结果进行分析比对。

1.2.5 反硝化条件优化 ①碳源：分别选择甲醇、柠檬酸钠、葡萄糖、乙酸钠、蔗糖、丁二酸钠作碳源。②C/N：培养基氮源含量不变，调节C/N为1、3、6、9、12。③温度：设置恒温振荡器温度为25、30、35、40、45、50 ℃。④pH：调节培养基初始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。⑤溶解氧：通过改变摇床转速来改变溶解氧浓度，设置转速分别为0、60、120、160、180、200 r/min。上述实验均在0 h和24 h取样检测，各实验均设3组平行，培养基量为100 mL，菌液接种量为5%(体积分数)。

2 结果与分析

2.1 菌株分离与鉴定

2.1.2 菌株形态与生理生化鉴定 菌株CZ1在普通培养基上菌落呈白色圆形，不透明，边缘整齐，表面湿润；革兰阳性，杆菌，有可见芽胞，见图1。接触酶、硝酸盐还原、V-P试验、淀粉水解、厌氧实验等均为阳性；氧化酶、明胶液化、酪氨酸、吲哚实验等均为阴性。由以上结果判断菌株CZ1为芽胞杆菌(Bacillus)。

图1 菌株CZ1的芽胞染色图Fig.1 Spore straining of CZ1箭头所指细长杆状为菌体，圆点为芽胞Arrow refers to the rod for the bacteria and the dot for spore

2.1.3 16S rDNA测序及系统发育树构建 通过对菌株CZ1进行16S rDNA基因序列测定，得到长度为1 446 bp的片段。将所得序列提交到GenBank数据库进行同源性比对，结果显示，与Bacilluscereusstrain CP1菌株的同源性高达99%，其系统发育树如图2所示。结合生理生化及形态实验鉴定的结果，判定该菌株是Bacilluscereus(蜡样芽胞杆菌)的可能性最大，命名为BacilluscereusCZ1。

图2 菌株CZ1的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain CZ1

2.2 菌株脱氮效率

图3 菌株CZ1的好氧反硝化性能及其生长曲线Fig.3 Aerobic denitrification capability and growth curve of strain CZ1

图4 菌株CZ1对氨氮的去除情况Fig.

2.3 反硝化条件优化实验

图5 不同碳源菌株CZ1的生长状况与脱氮效率Fig.5 Growth status and denitrification efficiency of CZ1 under different carbon sources

图6 不同碳氮比菌株CZ1的生长状况与脱氮效率Fig.6 Growth status and denitrification efficiency of CZ1 under different C/N ratio

图7 不同温度菌株CZ1的生长状况与脱氮效率Fig.7 Growth status and denitrification efficiency of CZ1 at different temperatures

图8 不同初始pH菌株CZ1的生长状况与脱氮效率Fig.8 Growth status and denitrification efficiency of CZ1 at different initial pH

图9 不同转速菌株CZ1的生长状况与脱氮效率Fig.9 Growth status and denitrification efficiency of CZ1 at different rotational speeds

3 讨 论

本研究从纯氧曝气池的活性污泥中筛选获得菌株CZ1，经鉴定判断为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。自好氧反硝化作用被发现以来，从芽胞杆菌属中已筛选出许多好氧反硝化菌，如赵惊鸿等[12]从燃煤电厂生物滴滤系统生物膜上筛选出的BacilluslicheniformisJH8，Zheng等[13]从乌梁素海底泥中筛选得到的BacillusmegateriumTGR30。芽胞杆菌具有芽胞的特征使其在环境中的生存能力大大增强，有利于适应复杂多变的水质。相比于其他菌种，芽胞杆菌应用于实际污水处理有着一定的优势。

环境因子是影响微生物生长与脱氮效果的重要因素。根据Takaya等[16]的研究发现，溶解氧、温度、C/N等都是影响菌株好氧反硝化效率的重要因素。本研究优化得到了菌株CZ1的最适生长条件：温度35 ℃，丁二酸钠为唯一碳源，C/N为6，初始pH值为7.0～7.5，转速为160 r/min。

当C/N过低时，碳源不足以满足菌体的生长，导致反硝化过程不彻底，微生物在代谢过程中容易将含氮化合物转化为气态N2O[17]，从而逸出进入环境，加剧温室效应。而C/N过高则会增加运行成本，同时出水水质也会受到影响。因此，有必要确定一个最佳菌株生长的C/N。目前已报道的菌株的适宜碳氮比大多超过10[13,18 -20]，而本研究结果显示，菌株CZ1的最佳C/N为6，有利于在实际污水处理中节约成本。

由于传统脱氮理论认为反硝化是一个严格厌氧的过程，因此溶解氧对好氧反硝化过程的重要影响是显而易见的。目前对于DO浓度如何影响好氧反硝化有两种理论：一种是阈值理论，认为在一定DO浓度范围内，存在一个DO浓度a，使得小于这个值时，反硝化效率随着DO浓度的降低而增大；另一种理论是存在一个DO浓度b，使得反硝化效率达到最大。本研究结果与第二种理论相符合。另外，因为菌株CZ1是从纯氧曝气池中的活性污泥筛选所得，其具有更高的耐氧范围，使得该菌株拥有更广阔的应用范围。

本研究未对菌株CZ1的气态产物作出鉴定，不清楚其具体的氮的转化途径，有必要进一步研究确定其气态产物。同时由于本研究采用的是单因素实验法探讨各因子对好氧反硝化的影响，而它们会对菌株产生相互影响，所以有必要采用响应面设计实验进一步优化菌株CZ1的反硝化条件，并且考虑使用实际废水以更深入准确地探索菌株的反硝化能力，为菌株的实际应用提供依据。

[1] 喻晓, 张甲耀, 刘楚良. 垃圾渗滤液污染特性及其处理技术研究和应用趋势[J]. 环境科学与技术, 2002, 25(5):43-45.

[2] 吴莉娜, 涂楠楠, 程继坤,等. 垃圾渗滤液水质特性和处理技术研究[J]. 科学技术与工程, 2014, 14(31):136-143.

[3] 高慧, 王敏. 垃圾渗滤液处理技术现状及展望[J]. 环境科学与技术, 2010,(s1):198-200.

[4] Robertson L A, van Niel E W, Torremans R A, et al. Simultaneous Nitrification and Denitrification in Aerobic Chemostat Cultures ofThiosphaerapantotropha[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1988, 54(11):2812-2818.

[5] 成钰, 李秋芬, 费聿涛,等. 海水异养硝化-好氧反硝化芽孢杆菌SLWX_2的筛选及脱氮特性[J]. 环境科学, 2016, 37(7):2681-2688.

[6] Jia K,Cui Z, He J, et al. Isolation and characterization of a denitrifying monocrotophos-degradingParacoccussp. M-1[J]. FEMS microbiology letters, 2006, 263(2): 155-162.

[7] Wu Z, Huang S, Yang Y, et al. Isolation of an aerobic denitrifying bacterial strain from a biofilter for removal of nitrogen oxide[J]. Aerosol and Air Quality Research, 2013, 13(3): 1126-1132.

[8] Chen J, Gu S, Hao H, et al. Characteristics and metabolic pathway ofAlcaligenessp. TB for simultaneous heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2016，100(22)：9787-9794.

[9] 杨麒, 李小明, 曾光明,等. 同步硝化反硝化机理的研究进展[J]. 微生物学通报, 2003, 30(4):88-91.

[10]东秀珠, 蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社, 2001：188-189.

[11]Buchanan R E,Gibbons N E. 伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M]. 北京：科学出版社，1984：535-536.

[12]赵惊鸿,黄少斌. 一株耐高温好氧反硝化菌的筛选及特性研究[J]. 环境科学与技术, 2015, 38(1): 6-10.

[13]Zheng X C, Guo X J, Na Y, et al. Screening and identification ofDenitrifyingbacillusstrain and its denitrification characteristics[J]. Chinese Journal of Ecology, 2012, 31(6):1447-1452.

[14]邹艳艳, 张宇, 李明智,等. 一株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离鉴定及脱氮活性研究[J]. 中国环境科学, 2016, 36(3):887-893.

[15]孙庆花, 于德爽, 张培玉,等. 海洋菌株y3的分离鉴定及其异养硝化-好氧反硝化特性[J]. 环境科学, 2016, 37(3):1089-1097.

[16]Takaya N, Catalan-Sakairi M A B, Sakaguchi Y, et al. Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide[J]. Applied and environmental microbiology, 2003, 69(6): 3152-3157.

[17]张苗, 黄少斌, 肖先念. C/N和pH值对高温好氧反硝化菌产N2O的影响研究[J]. 环境工程学报, 2012, 6(1):275-279.

[18]黄廷林, 张丽娜, 张海涵,等. 一株贫营养异养硝化-好氧反硝化菌的筛选及脱氮特性[J]. 生态环境学报, 2015,24(1):113-120.

[19]郭强，杨云龙，陈宏平.一株地衣芽孢杆菌异氧硝化——好氧反硝化特性研究[J]. 环境科学与技术, 2015，38(7)：38-42.

[20]Zhao B, He Y L, Zhang X F. Nitrogen removal capability through simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification byBacillussp. LY.[J]. Environmental Technology, 2010, 31(4):409-416.

Screening of Aerobic Denitrification Bacteria in Landfill Leachate and Its Denitrification Conditions Optimization

YI Li1, 2, HUANG Shao-bin1, 2, PAN Meng-lan1, 2

(1.Coll.ofEnviron’t&Energy,S.ChinaUni.ofTechnol.,Guangzhou510006; 2.KeyLab.ofPollut’nCtrl. &Eco-Restorat’nofGuangdongOrd.Coll，Guangzhou510006)

An aerobic denitrifying bacterium, named CZ1, was isolated from the activated sludge in pure oxygen aeration tank of a landfill leachate treatment plant in Changzhou City, Jiangsu Province. CZ1 was identified initially asBacilluscereusthrough morphology, physiological and biochemical identification and 16S rDNA gene sequence analysis. Study on aerobic denitrification characteristics of the strain CZ1, the results showed that the nitrate removal rate within 24 h was 97.69% with potassium nitrate being the only nitrogen source. Meanwhile, the effects of carbon source, C/N, temperature, initial pH, and dissolved oxygen on the aerobic denitrification capacity of the strain were studied. The optimum aerobic denitrification conditions were obtained by single-factor experiment as follows: temperature at 35 ℃, sodium succinate as sole carbon source, C/N ratio at 6, and initial pH at 7.0-7.5, rotation at 160 r/min.

landfill leachate; isolation and identification;Bacilluscereus; denitrification conditions

广东省科技计划项目(2014B050505004)

易立 男，硕士研究生。研究方向为环境微生物学。E-mail:120877339@qq.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。研究方向为环境生物化学技术。E-mail:chshuang@scut.edu.cn

2016-05-03；

2016-05-16

Q939.9

A

1005-7021(2017)02-0041-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.006